一个中国LHON大家系中新核修饰因子的发现与鉴定

摘要

LHON是一种常见的线粒体母系遗传视神经病变，主要累及视网膜神经节细胞，临床主要表现为双眼同时或先后发生急性或亚急性的视力减退，同时伴有中心视野缺失和色觉障碍，病理改变显现为视盘周围神经纤维层肿胀和毛细血管扩张。线粒体DNA的3个原发性突变(G11778A、G3460A、 T14484C)是LHON的主要分子发病基础，却不足以阐明LHON的不完全外显、男性好发等特性，这表明LHON致病还受其它遗传因素、环境因素的影响。不完全外显和男性好发是LHON的两大特性，也是目前亟待解决的难题。
　　我们在研究中发现一个具有高外显率(80％)、较低男女比率(1∶1.7) LHON家系（WZ162家系），研究发现mtDNA继发突变及其他相关突变可能对此家系LHON发病无重要作用，我们推测可能存在核基因突变影响此家系LHON高外显率。为寻找与此家系发病相关的核修饰基因，我们选择此家系一名携带者Ⅱ-10，三名患者Ⅱ-1、Ⅲ-3、Ⅲ-6进行全基因组外显子测序，并从33例错义突变、9例插入缺失、4例剪切位点突变中筛选出一个核基因突变-PRICKLE3 c.157C＞T。此突变导致PRICKLE3蛋白第53位高度保守的精氨酸(R)变为色氨酸(W)，只存在WZ162家系的患者中，女性患者为杂合突变，男性患者为纯合突变，家系内正常对照及携带者均不含此突变，符合X连锁的显性遗传模式。此外，此突变在筛查436位正常对照和179位来自55个LHON家系的母系成员与105位散发患者中均不存在。再通过Sanger测序对PRICKLE3基因的全外显子区域进行验证，发现除c.157C＞T外，9个外显子区域均不含其他突变。
　　经过定位分析，我们发现PRICKLE3蛋白部分位于线粒体内，可能与线粒体功能关联。同时它在多种细胞及脑、肝脏、肾脏、肺、胎盘、胰脏等器官广泛表达。为阐明PRICKLE3 c.157 C＞T突变对线粒体功能的影响，我们构建了来自家系患者、携带者及正常对照的永生化淋巴细胞系，并进行一系列与线粒体功能相关的生化检测。
　　生化检测结果如下0(1)PRICKLE3蛋白表达检测显示粗提线粒体总蛋白中对照组、携带者组、患者组的相对表达量分别为0.90、0.82、0.91，细胞总蛋白中对照组、携带者组、患者组的相对表达量分别为1.11、1.26、1.15，三组相互比较无显著差异(P＞0.05)。(2)线粒体呼吸链亚基蛋白表达检测显示患者组ATP6亚基的相对表达量显著低于携带者组(P=0.01)和对照组(P=0.05)，分别降低了35％、44％;ND4、ND5、ND6、CYTB、CO2亚基相对表达量三组间无显著差异(P＞0.05)(3)细胞氧耗(OCR)实时测定发现患者组的基础OCR、ATP产能相关OCR、最大呼吸OCR分别比对照组降低了52％、59％、52％(P＜0.01);同时与携带者相比，患者组ATP产能相关OCR值下降幅度增大了24％(P＜0.05)。(4)ATP检测发现，与对照组相比较，患者组氧化磷酸化ATP产量减少了63％(P＜0.01)，携带者组氧化磷酸化ATP产量减少了43％(P=0.05)，患者组氧化磷酸化ATP产量的下降幅度增大了20％(P＜0.01)，与患者组ATP6亚基的表达量降低及ATP产能相关OCR值下降幅度增大的结果一致。(5)膜电位检测显示携带者组和患者组线粒体膜电位低于对照组，差异显著(P＜0.05)，但患者组与携带者组相比较，膜电位相似，无显著差异(P＞0.05)。(6)在H2O2刺激下，对照组、携带者组、患者组的ROS水平的平均值分别为1.68、2.12、2.55，患者组、携带者组ROS水平提高幅度均显著大于对照组（P＜0.05）;但患者组与携带者组相比较，ROS水平无明显提高（P＞0.05）。
　　通过以上检测和分析，我们在WZ162家系发现了一个新的核基因突变位点PRICKLE3c.157C＞T。该突变符合X-连锁显性遗传模式，在淋巴细胞系中可促进线粒体ATP的产能降低，可能影响此家系外显率。但PRICKLE3 c.157C＞T影响线粒体产能、调控LHON发病具体机制还有待于进一步研究。

目录

声明

致谢

摘要

英文

1 引言

1．1 线粒体与线粒体疾病

1．1．1 线粒体的功能及调控

1．1．2 线粒体疾病遗传模式及发病特点

1．2 LHON的研究现状

1．2．1 LHON的发现历史

1．2．2 与LHON相关的原发性突变

1．2．3 LHON临床表现及诊治

1．2．4 影响LHON发病的因素

1．3 二代测序技术与新致病基因的发现

1．3．1 第二代测序技术的发展

1．3．2 全基因组外显子测序与致病基因的发现

1．3．3 全基因组外显子测序的基本思路及技术路线

1．4 本课题的研究思路

2 实验材料与方法

2．1 临床样本

2．1．1 样本来源及细胞株简介

2．1．2 家系谱系

2．1．3 临床资料及照片

2．2 研究试剂

2．2．1 化学试剂

2．2．2 化学试剂试剂盒

2．2．3 抗体

2．3 主要仪器及器材

2．4 常用试剂溶液及培养基的配制

2．4．1 感受态细胞制备及转化试剂

2．4．2 细胞培养基

2．4．3 血液DNA提取所用试

2．4．4 聚丙烯酰胺凝胶贮存液的配制

2．4．5 淋巴细胞建系试剂

2．4．6 OCR测定所用试剂

2．4．7 ATP测定所用试剂

2．5 引物

2．5．1 扩线粒体全序引物

2．5．2 PRICKLE3外显子筛查所用引物

2．5．3 酶切鉴定PRICKLE3 157位点PCR扩增引物

2．5．4 鉴定PRICKLE3表达QPCR扩增引物

2．6 实验方法

2．6．1 血液DNA的提取方法

2．6．2 PCR扩增及酶切鉴定、测序

2．6．3 荧光定量PCR

2．6．4 PRICKLE3蛋白细胞定位

2．6．5 线粒体提取

2．6．6 永生化淋巴细胞系的建立

2．6．7 Western Blot检测蛋白表达

2．6．8 OCR测定

2．6．9 ATP测定

2．6．10 ROS测定

2．6．11 线粒体膜电位测定

3 实验结果

3．1 WZ162家系分析

3．2 WZ162家系全基因组外显子测序结果

3．2．1 原始数据概况

3．2．2 目标区域内每个样本的测序深度情况

3．2．3 样本的目标区域内外显子捕获测序的均一性

3．2．4 CCDS外显子的测序深度和覆盖度

3．2．5 全基因组外显子测序数据SNP的检测与注释

3．2．6 插入觖失(indels)注释

3．2．7 基因突变分析

3．3 PRICKLE3蛋白定位

3．4 PRICKLE3基因组织表达情况

3．5 PRICKLE3蛋白表达检测

3．6 呼吸链亚基表达检测

3．7 OCR检测、ATP检测

3．8 线粒体ROS、膜电位检测

4 讨论

5 展望

参考文献

简历