传统酸面团中微生物多样性及其风味物质代谢研究

摘要

酸面团在中国又称作老面、酵子等，是制作主食馒头等的传统发酵剂，在中国已有1000多年的应用历史。酸面团发酵的馒头，一般称为老面馒头，深受消费者的喜爱。然而国内对于酸面团微生物组成及其发酵面团过程中的物质代谢尚缺乏系统的研究和认识。本文收集了不同地区的酸面团对其中的微生物组成进行了分析，并运用分离得到的菌种进行面团发酵，探究了挥发性风味物质的产生和变化，并结合RNA测序，分析了主要微生物发酵过程中的基因表达情况。
　　对采自全国不同地区的15个酸面团中的乳酸菌和酵母菌进行分离培养，共发现乳酸菌11种，分别为旧金山乳杆菌、面包乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌、类食品乳杆菌、明登乳杆菌、瑞士乳杆菌、罗斯乳杆菌(Lactobacillus rossiae)、屎肠球菌和肠膜明串珠菌，结果表明，旧金山乳杆菌是中国传统酸面团中的优势菌种。分离得到酵母菌6种，分别为酿酒酵母、矮小假丝酵母（Candidahumilis，同Kazachstania humilis）、异常威克汉姆酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、扣囊复膜酵母和膜醭毕赤酵母，其中，酿酒酵母数量最多，是酸面团中的优势酵母菌。膜醭毕赤酵母首次发现于中国的传统酸面团中。
　　对这15个酸面团样品中的细菌进行高通量测序分析，结果表明酸面团中的细菌绝大部分是乳酸菌，主要以乳杆菌为主，其次是魏斯氏菌属和明串珠菌属，这三个属的乳酸菌含量较多，分布较广泛。其他一些在个别样品中含量相对较多的菌包括薄层菌属、罗尔斯通菌属、醋杆菌属、甲基杆菌属、不动杆菌属、泛菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属、气单胞菌属、红球菌属和微杆菌属。高通量测序的结果同样表明，旧金山乳杆菌是中国传统酸面团中的优势菌种，是唯一在所有样品中均有发现的菌种，在多数样品中含量超过50％。其他含量较高的乳酸菌包括融合魏斯氏菌、假肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、罗斯乳杆菌、短乳杆菌等。结果表明，酸面团微生物组成既有统一性又有独特性，与地域分布无明显的关联。
　　利用分离得到六种酵母进行面团发酵，结果表明六株酵母中发酵力大小依次为Candida humilis(Kazachstania humilis)HB13＞Saccharomyces cerevisiae9Y3＞Wickerhamomyces anomalus HN9＞Pichia kudriavzevii11Y11＞Saccharomycopsis fibuligera HN13＞Pichia membranifaciens14Y6。Pichia membranifaciens14Y6无面团起发能力。不同酵母制作的馒头中，总共发现41种挥发性化合物，包括醇类11种，醛类11种，酮类5种，酸类9种，酯类3种及2种其他类化合物。其中，酿酒酵母产生的风味物质较多。风味物质在酿酒酵母发酵过程中呈现出不同的变化:1、大部分的挥发性风味物质含量随着发酵的进行而升高，如乙酸乙酯、乙醇、2，3-戊二酮、2-甲基1-丙醇、3-甲基-1-丁醇等;2、一些物质随着发酵进行减少或不变，如己醛、丁醇、戊醇、乙酸、丁内脂、戊酸;3、发酵过程中3-甲基丁醛和乙偶姻含量先升高后下降。与发酵6h的面团相比，发酵12h的面团中，酿酒酵母的85个基因表达量发生了明显的上调。这些基因主要涉及碳水化合物（二糖、低聚糖）、氨基酸、有机酸的合成与代谢及跨膜运输。
　　利用分离得到乳酸菌进行面团发酵，大多数的乳酸菌在发酵4小时后产酸速度明显加快，在4-10h时产酸能力最强。在发酵12h的发酵面团中共发现33种挥发性化合物，包括5种醇类，11种醛类，6种酮类，5种酸类，3种酯类和3种其他化合物。异型发酵乳酸菌发酵面团中主要为乙醇、乙酸、乙酸乙酯和乳酸乙酯等。同型发酵乳酸菌面团则含有较多醛类、酮类。旧金山乳杆菌发酵过程中，乙醇、己醇、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、丁酸、戊酸和己酸等随着发酵的进行含量逐渐增加。基因表达分析结果表明，发酵12h后，旧金山乳杆菌的生长增殖速度显著降低，但代谢速度未发现显著下降。
　　将酿酒酵母和旧金山乳杆菌混合发酵面团，结果表明，虽然旧金山乳杆菌中与乳酸和乙酸生成相关的一些基因下调表达，但混合发酵对旧金山乳杆菌的最终产酸量未产生实质影响。同时，与单独发酵相比，混合发酵的酸面团中旧金山乳杆菌中氨基酸代谢和肽聚糖合成相关的基因的表达量显著升高，表明混合培养或许可能对旧金山乳杆菌的生长和繁殖有一定的促进作用，然而菌落计数表明，混合发酵未对旧金山乳杆菌的生长有明显的影响。另一方面，菌落计数表明旧金山乳杆菌的存在有利于酿酒酵母在面团中的生长繁殖。混合发酵面团的挥发性风味物质包含两种菌各自所产生的物质，但产量大都少于两者单独发酵的之和，表明两者之间存在相互影响。

目录

论文说明

声明

致谢

摘要

英文缩略词

第1章 绪论

1．1 酸面团

1．1．1 酸面团的定义与分类

1．1．2 酸面团的微生物组成

1．1．3 酸面团微生物多样性研究方法

1．1．4 传统酸面团在应用中的挑战

1．2 高通量测序技术

1．2．1 高通量测序技术简介

1．2．2 HTS在传统发酵食品微生态研究中的应用

1．2．3 RNA测序(RNA-seq)

1．3 发酵面制品的风味研究

1．3．1 发酵面制品风味物质及其来源

1．3．2 微生物发酵过程对风味的影响

1 ．3．3 顶空固相微萃取技术及其在面制品风味研究中的应用

1．4 本课题立题依据及研究内容

1．4．1 立题依据及研究目的

1．4．2 研究内容

1．5 本课题技术路线

第2章 基于分离培养法的乳酸菌和酵母菌多样性

2．1 材料与方法

2．1．1 样品采集

2．1．2 培养基

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 pH值与可滴定酸度(TTA)的测定

2．1．6 乳酸菌和酵母菌含量测定

2．1．7 乳酸菌的分离

2．1．8 酵母菌的分离

2．1．9 乳酸菌的rep-PCR分析

2．1．10 酵母菌的RAPD分析

2．1．11 酵母菌与乳酸菌的测序鉴定

2．1．12 数据统计分析

2．2 结果与讨论

2．2．1 酸面团酸度与微生物含量

2．2．2 传统酸面团中乳酸菌多样性

2．2．3 传统酸面团中酵母菌多样性

2．3 本章小结

第3章 高通量测序探究酸面团细菌多样性

3．1 材料与方法

3．1．1 样品采集

3．1．2 样品总DNA提取

3．1．3 细菌测序引物及目标区域扩增

3．1．4 上机测序与原始数据处理

3．1．5 OTU聚类及注释

3．1．6 稀释曲线和丰度分布曲线分析

3．1．7 Alpha多样性分析

3．1．8 样品群落组成分析

3．1．9 Beta多样性分析

3．2 结果与讨论

3．2．1 PCR产物检测

3．2．2 优质序列筛选及长度分布

3．2．3 酸面团物种丰度与多样性

3．2．4 酸面团物种组成鉴定与比较

3．3 本章小结

第4章 不同种类酵母发酵对面团和馒头风味的影响

4．1 材料与方法

4．1．1 主要材料与试剂

4．1．2 主要仪器设备

4．1．3 酵母菌株

4．1．4 酵母单糖发酵试验

4．1．5 酵母发酵力测定

4．1．6 酵母发酵面团与馒头制备

4．1．7 发酵面团酸度变化

4．1．8 发酵面团及馒头风味物质测定

4．1．9 气相质谱条件

4．1．10 HS-SPME法提取馒头风味物质条件优化

4．1．11 馒头质构测定

4．1．12 发酵面团总RNA提取

4．1．13 测序文库构建

4．1．14 上机测序与数据前处理

4．1．15 差异表达基因分析

4．1．16 Gene ontology(GO)与KEGG Pathway代谢途径分析

4．1．17 风味物质数据分析

4．2 结果与讨论

4．2．1 各酵母菌株的糖发酵谱

4．2．2 各酵母菌株面团发酵力测定

4．2．3 各酵母菌株面团发酵过程中的酸度变化

4．2．4 SPME萃取条件的选取

4．2．5 不同酵母馒头的质地和风味分析

4．2．6 发酵过程中的风味动态变化

4．2．7 酵母发酵过程中基因表达的变化

4．3 本章小结

第5章 乳酸菌代谢产生的风味物质

5．1 材料与方法

5．1．1 主要材料与试剂

5．1．2 主要仪器设备

5．1．3 乳酸菌菌株

5．1．4 乳酸菌菌株准备与面团发酵

5．1．5 发酵面团酸度变化测定

5．1．6 发酵面团风味物质测定

5．1．7 发酵面团总RNA提取

5．1．8 测序文库构建

5．1．9 上机测序与数据前处理

5．1．10 差异表达基因分析

5．1．12 风味数据分析

5．2 结果与讨论

5．2．1 发酵面团酸度变化

5．2．2 乳酸菌发酵面团中的风味物质

5．2．3 乳酸菌发酵过程中面团的风味变化

5．2．4 旧金山乳杆菌面团发酵过程中的基因表达变化

5．3 本章小结

第6章 发酵面团中酵母菌和乳酸菌的相互作用

6．1 材料与方法

6．1．1 主要材料与试剂

6．1．2 主要仪器设备

6．1．3 实验菌株

6．1．4 菌株准备与面团发酵

6．1．5 发酵面团酸度变化测定

6．1．6 发酵面团菌含量测定

6．1．7 发酵面团风味物质测定

6．1．8 发酵面团总RNA提取

6．1．9 测序文库构建

6．1．10 上机测序与数据前处理

6．1．11 差异表达基因分析

6．1．12 Gene ontology(GO)与KEGG Pathway代谢途径分析

6．1．13 风味数据分析

6．2 结果与讨论

6．2．1 发酵面团的酸度测定

6．2．2 发酵面团菌落计数

6．2．3 风味物质的比较

6．2．4 基因表达差异测定

6．3 本章小结

第7章 结论与展望

7．1 本论文的主要结论

7．2 后续研究展望

参考文献

附录

附：作者简历