与苦苣菜黄网病毒(SYNV)P蛋白互作的寄主蛋白对SYNV侵染影响的研究

摘要

苦苣菜黄网病毒（SYNV)是一种单股负链RNA病毒，它侵染菊科植物，是重要的作物病毒病原之一。SYNV的核衣壳蛋白P是一种磷蛋白，是聚合酶复合体的重要成分之一。SYNVP蛋白能与N蛋白互作来调控病毒复制和转录之间的转换，它与细胞核输入和细胞核内病毒发生基质有关。此外，P蛋白也是一个有效的病毒沉默抑制子。研究P蛋白功能对于揭示SYNV病毒致病机理及抗寄主的防御机制等具有重要意义。本研究利用酵母双杂交技术筛选与SYNVP蛋白互作的寄主本氏烟蛋白，通过构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV）沉默载体浸润接种本氏烟沉默相关基因，来观察基因沉默对SYNV侵染的影响，从而筛选出与SYNV侵染有关的寄主基因。研究成果将为了解在 SYNV侵染过程中病毒与寄主的互作机制，进而为制定SYNV防控策略奠定基础。
　　本研究以SYNV的P蛋白作为诱饵，利用酵母双杂交技术筛选本氏烟的cDNA文库，通过QDO和QDO/X培养基双重筛选，获得125候选的阳性克隆。经过点滴稀释培养及自结合实验验证，排除假阳性后共获得107个阳性质粒。利用基因测序及序列分析，最终获得48个已知序列，它们编码的蛋白质能在酵母中与SYNVP蛋白互作，其中有16个序列所表达的蛋白质与遗传信息储存和处理相关，17个与细胞过程和信号转导有关，12个与物质合成代谢及能量转换相关，还有3个功能未知。构建了41个TRV沉默载体，分别用于沉默与P互作的41个寄主蛋白的基因，通过浸润接种法将重组TRV载体侵染本氏烟后进行表型观察，发现8个沉默载体接种后能引起本氏烟表型的显著变化，4个虽会引起表型改变但不影响后续实验，另外还有29个表型变化不明显，通过RT-PCR检测证明了TRV载体都已成功侵染本氏烟。最终选择33个基因用于后续研究，即接种 TRV沉默载体10d后，再摩擦接种SYNV来观察基因沉默对SYNV侵染的影响。通过小批量接种后症状观察及方差分析，初步确定18个基因的沉默可能会对SYNV的侵染造成影响。Western blot分析表明病毒积累量的差异与对应植株症状表型差异相符合。扩大 SYNV接种株数，利用发病时间的趋势及方差分析，最终确定有2个（22＃和38＃）基因的沉默会推迟SYNV发病时间，检测结果说明这2个基因的沉默效率较好，都大于70％。另外，还对5＃、11＃、13＃、22＃4个进行基因沉默并接种SYNV的微型复制子系统，发现11＃、13＃和22＃3个基因的沉默会影响P蛋白的转录功能。

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第一章 文献综述

1.1苦苣菜黄网病毒研究进展

1.1.1 SYNV病毒结构

1.1.2 SYNV蛋白特点及功能

1.1.3 SYNV的复制

1.1.4 微型复制子的建立

1.2酵母双杂交技术

1.2.1酵母双杂交技术的原理

1.2.2酵母双杂交技术的优点

1.2.3酵母双杂交技术的局限性

1.2.4酵母双杂交技术在植物病毒研究中的应用

1.3病毒诱导的基因沉默

1.3.1 VIGS的发现

1.3.2 VIGS载体的建立

1.3.3 VIGS的机制

1.3.4烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）沉默载体

1.3.5 TRV诱导的基因沉默在植物病毒研究中的应用

1.3.6 VIGS的优势

1.3.7 VIGS的局限性

1.4本课题的研究目的与意义

第二章 利用酵母双杂交技术筛选与SYNV P互作的寄主蛋白

2.1 材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 主要试剂

2.2 方法

2.2.1 与SYNV P蛋白互作的寄主蛋白初步筛选

2.2.2与SYNV P蛋白互作的寄主蛋白进一步筛选

2.2.3 酵母点滴稀释培养法鉴定与SYNV P蛋白互作的寄主蛋白

2.2.4 与P蛋白互作的寄主蛋白序列分析

2.3 结果与分析

2.3.1与SYNV P蛋白互作的寄主蛋白初步筛选

2.3.2.与SYNV P蛋白互作的寄主蛋白进一步筛选

2.3.3酵母点滴稀释培养法鉴定与SYNV P蛋白互作的寄主蛋白

2.4讨论

第三章 利用 VIGS 技术研究与P互作的寄主蛋白对SYNV侵染的影响

3.1材料

3.1.1植物材料

3.1.2菌株和质粒

3.1.3主要试剂

3.2 方法

3.2.1.利用同源重组克隆技术构建TRV沉默载体

3.2.2 重组质粒导入农杆菌

3.2.3 目的基因沉默对本氏烟表型的影响

3.2.4 基因沉默对SYNV侵染的影响

3.2.5基因沉默效率检测

3.2.6基因沉默对微型复制子的影响

3.3结果与分析

3.3.1利用同源重组技术构建TRV沉默载体

3.3.2 重组质粒导入农杆菌

3.3.3 目的基因沉默对本氏烟表型的影响

3.3.4基因沉默对SYNV侵染的影响

3.3.5基因沉默效率检测

3.3.6 基因沉默对微型复制子的影响

3.4讨论

小结

参考文献

附录： 常用缓冲液及试剂的配制