分泌抗苦苣菜黄网病毒P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗应用

摘要

本发明公开了一种分泌抗苦苣菜黄网病毒P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗应用。以SYNV重组P蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠，获得稳定传代并分泌抗SYNV？P蛋白的单抗杂交瘤细胞株4D1，其保藏号为CGMCCNo.9326。单抗腹水间接ELISA效价为1:128000，单抗重链和轻链类型为IgG2b和Lamda型。间接ELISA检测原核表达P蛋白和SYNV病汁液的灵敏度分别为0.188？μg/mL和1:320。此外，4D1细胞株单抗还能检测出通过植物真核表达载体而在烟草中表达的P蛋白。SYNV？P蛋白单抗的研制为SYNV病毒的检测及防控，以及P蛋白与寄主和病毒其他蛋白的互作研究奠定基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗苦苣菜黄网病毒P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗检测应用。

背景技术

苦苣菜黄网病毒(Sonchusyellownetvirus，SYNV)是一种细胞核内复制的负链RNA病毒，它侵染菊科植物，在莴苣等农作物上造成病毒病害。SYNV属于弹状病毒科细胞核弹状病毒属，该科成员引起大量人类、野生动物和农业上的严重病害，造成重大经济损失，甚至一些对人类健康构成致命威胁。SYNV病毒粒子包含一个具有侵染性的核衣壳，核衣壳外面包裹一层磷酸脂质包膜。核衣壳由一条长为13720个核苷酸的负链RNA以及包被核酸的N、P和L蛋白组成。SYNV基因组由6个基因组成，依次为3′-N-P-sc4-M-G-L-5′。目前已知SYNVN蛋白包裹SYNV基因组和反基因组RNA，形成核糖核酸酶来阻止螺旋状复合体。N蛋白的C末端有一个典型的双向核定位信号，介导与核输入蛋白的结合。同源N蛋白自身互作对病毒在细胞核内亚核复制位点的形成具有重要意义。sc4蛋白可能与病毒的细胞间移动有关。M蛋白与核衣壳形成过程中产生一个紧密的线圈结构有关，并且介导与G蛋白的结合。G蛋白是一种糖蛋白，形成了SYNV病毒粒子包膜外的刺突。L蛋白包含负链RNA病毒的RNA依赖的RNA聚合酶，与P蛋白形成复合体存在于核衣壳内。L蛋白还含有核定位信号，在病毒核定位上起作用。SYNVP蛋白能与N蛋白互作来调控病毒复制和转录之间的转换，它与细胞核输入和细胞核内病毒发生基质有关。此外，P蛋白也是一个有效的病毒沉默抑制子。SYNVP蛋白单抗的研制为SYNV病毒的检测与防控，以及P蛋白与寄主和病毒的其他蛋白的互作研究奠定基础。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗苦苣菜黄网病毒P蛋白的单抗杂交瘤细胞株，并建立SYNV病毒及其P蛋白的免疫检测方法。

一种分泌抗苦苣菜黄网病毒P蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9326，保藏时间为2014年6月24日，它能分泌抗苦苣菜黄网病毒P蛋白的单克隆抗体。

所述的杂交瘤细胞株分泌。所述单克隆抗体的重链和轻链类型分别为IgG2b和Lamda型，当包被原为3μg/mL时，细胞株单抗腹水间接ELISA效价为1:128000。

所述的苦苣菜黄网病毒P蛋白单克隆抗体在苦苣菜黄网病毒及其P蛋白检测上的应用。

所述的抗体根据间接ELISA检测方法对苦苣菜黄网病毒及其P蛋白进行检测。

本发明提供的抗苦苣菜黄网病毒P蛋白的单克隆抗体，不仅能成功用于检测原核表达的P蛋白，以及通过植物真核表达载体pGD-P浸润接种而在烟草中表达的P蛋白，而且能够有效检测出被侵染植物中的SYNV病毒。SYNVP蛋白单抗的研制为SYNV病毒的检测及防控，以及P蛋白与寄主和病毒其他蛋白的互作研究奠定基础。

附图说明

图1是细胞株4D1单抗亚类鉴定；

图2是细胞株4D1单克隆抗体检测病汁液的灵敏度。

具体实施方式

分泌抗苦苣菜黄网病毒P蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，于2014年6月24日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏号为CGMCCNo.9326，它能分泌抗苦苣菜黄网病毒P蛋白的单克隆抗体；

抗SYNVP蛋白的单抗腹水间接ELISA效价为1:128000。单抗的重链和轻链类型分别为IgG2b和Lamda型。单抗能与SYNV重组的P蛋白发生特异性反应。

抗苦苣菜黄网病毒P蛋白的单克隆抗体在SYNV病毒及其P蛋白检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的免疫检测方法。

本发明提供的抗苦苣菜黄网病毒P蛋白的单克隆抗体，不仅能特异性地用于检测原核表达的P蛋白、以及通过植物真核表达载体pGD-P介导而在烟草中表达的P蛋白，而且能够有效检测出侵染植物中的SYNV病毒。以所制备单抗为核心建立的间接ELISA方法能快速灵敏、高效特异检测SYNV病毒及其P蛋白。

下面结合实施方式和附图对本发明作进一步说明。

一、苦苣菜黄网病毒P蛋白免疫抗原与检测抗原的制备

从感染SYNV的本氏烟叶片中提取总RNA，根据已发表的SYNVP蛋白基因(登录号为：M23023)设计并合成一对特异性引物(5'端引物：5'-CGGGGATCCATGGAAATCGAT-3'，3'端引物：5'-GCCTCGAGTTATTAGATATAGATGGGTG-3’)。用RT-PCR方法扩增获得SYNVP基因，纯化PCR产物，连接pMD-18T克隆载体，转化E.coliDH5a菌株，PCR和BamHI、XhoI双酶切鉴定阳性重组质粒并测序。测序结果表明所克隆的SYNV-P基因的序列为1038bp个核苷酸，编码346个氨基酸，与GenBank上登录SYNV其他4个分离物的P基因核苷酸同源性为96-99％。把已克隆获得的SYNVP基因连接到原核表达载体pET30a上，构建重组表达载体pET30a-P，转化E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导表达重组蛋白，Ni²⁺-NTA亲和柱纯化获得分子量约为42kDa的融合蛋白，以纯化的重组P蛋白为免疫抗原与检测抗原，用于单抗的制备和检测应用。

二、抗苦苣菜黄网病毒P蛋白单克隆抗体的制备

1.动物免疫

纯化的重组P蛋白为抗原免疫8周龄左右的雌性BALB/C小鼠，经背腹部皮下多点注射，每只小鼠的免疫原量为50μg。第一次免疫用完全佐剂乳化的抗原；3周后第二次免疫(用不完全佐剂乳化抗原)；再间隔2-3周进行第三次免疫，抗原量加倍，但不加佐剂；2周后第四次免疫，不加佐剂，抗原量与第三次相同；第四次免疫3d后进行细胞融合，也可以再进行一次加强免疫。

2.细胞融合

选取已到达理想效价的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞按10:1的比例在RPMI-1640培养液中混匀，1500rpm离心5min，弃上清。置37℃水浴中，滴加50％PEG3350溶液1mL，融合2min。然后加入30mLRPMI-1640无血清培养液终止融合反应，再1500rpm离心5min，弃上清。用适量HAT培养液悬浮细胞沉淀，再将细胞悬液加入96孔培养板中，置于37℃、含有5％CO₂培养箱内培养。

3.杂交瘤细胞筛选与克隆

每3d后更换一次杂交瘤细胞的培养液，第10d后改用HT培养液。第15d左右，当杂交瘤细胞生长孔培养液颜色变黄，细胞占孔底面积大于1/4，且生长良好时，采用间接ELISA法对细胞培养上清进行检测。挑选出其中阳性OD值较高的孔，以有限稀释法进行克隆及亚克隆，每次均进行间接ELISA筛选阳性克隆，最后获得1株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D1，经扩大培养后，用于单抗腹水制备和液氮保存。

4.单抗制备、纯化及浓度检测

每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL降植烷，2周后注射杂交瘤细胞，10d后采集腹水，将收集的腹水3000rpm离心10min，取上清，上清即为单抗腹水。P蛋白腹水单抗经ProteinA/GAgarose纯化后，用紫外分光光度计扫描测定单抗的浓度，经检测P蛋白4D1细胞株单抗浓度为9.245mg/mL。单抗置于-70℃冷冻保存。

5.单抗效价测定

以P蛋白为抗原，纯化后的单抗倍比稀释后为一抗进行间接ELISA检测，实验结果表明，在P蛋白抗原浓度为3μg/mL时，4D1细胞株单抗的效价为1:128000。

6.单抗亚类鉴定

采用sigma公司的鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒对单抗免疫球蛋白类型及亚类进行鉴定。通过亚类检测试剂盒，测得4D1细胞株单抗的重链类型是IgG2b，轻链类型为Lamda型，如图1所示。

7.单抗Westen-blot分析

分别以含空载体的菌体蛋白、含重组质粒pET30a-p未诱导的菌体蛋白、含重组质粒pET30a-p经IPTG诱导的菌体蛋白、纯化的P蛋白进行SDS-PAGE电泳和Western分析，Westernblot结果表明，4D1细胞株单抗能与42kD的P蛋白特异性结合，这说明所制备的单抗是针对SYNVP蛋白的特异性抗体。

三、抗苦苣菜黄网病毒P蛋白单克隆抗体的检测应用

1.间接ELISA(id-ELISA)检测方法的建立

以纯化的重组P蛋白为包被抗原，以所制备的P蛋白单抗为一抗，建立id-ELISA检测方法，具体步骤如下：

(1)包被：把抗原加入酶标板中，100μL/孔，4℃过夜；用PBST洗涤3次，每次间隔3min，拍干。

(2)封闭：加入封闭液，200μL/孔，37℃孵育1h。

(3)一抗孵育：加入已稀释的抗血清，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤方法同上。设置阴性对照和空白对照。

(4)加入酶标二抗：加入已稀释的HRP标记羊抗鼠IgG为二抗，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤方法同上。

(5)显色反应：加入TMB底物显色液，100μL/孔，37℃，显色15min。

(6)终止反应：加入终止液，50μL/孔，用酶标仪测定其OD₄₅₀值。以P/N≥2.1的抗血清最高稀释倍数作为抗血清的ELISA效价。P为待测小鼠血清OD值减去空白对照OD值，N为阴性对照OD值减去空白对照OD值。

2.间接ELISA最适工作浓度的测定

以1:2000开始倍比稀释的P蛋白为包被原；以1:1000开始倍比稀释的P蛋白单抗为一抗，利用间接ELISA法进行方阵实验。为了尽可能避免非特异性反应，增强ELISA检测的灵敏度，本试验选择OD值约为1.0时，酶标二抗的工作浓度为1:10000，抗原稀释度为1:4000，4D1单抗稀释度为1:16000为ELISA最佳工作浓度。

3.间接ELISA法检测原核表达的P蛋白及灵敏度

以纯化的原核表达P蛋白为包被原，以所制备的P蛋白单抗为一抗，建立原核表达的P蛋白id-ELISA检测方法。将6mg/mLP蛋白从1:2000开始倍比稀释后为抗原，在单抗最适工作浓度下，采用id-ELISA检测P蛋白的灵敏度。通过实验得出4D1细胞株单抗检测P蛋白的灵敏度为1:16000，即P蛋白的浓度为0.188μg/mL。

4.间接ELISA法检测SYNV病毒及灵敏度

取0.1g感染SYNV的本氏烟病叶，加入1mL包被缓冲液进行研磨。以SYNV病汁液为包被原，以所制备的P蛋白单抗为一抗，建立SYNV病毒的id-ELISA检测方法。将病汁液从1:5-1:2560进行倍比稀释后为抗原，并以对应稀释度的健叶汁液为阴性对照，在单抗最适工作浓度下进行id-ELISA测定。病汁液从1:20-1:320是较理想的稀释度，当稀释度为1:640时，P/N已小于2.1，所以可确定SYNV病汁液1:320稀释度为检测极限，如图2所示。

5.间接ELISA法检测在烟草中表达的P蛋白

将P基因插入植物表达载体PGD，构建植物表达载体PGD-P，转化农杆菌GV3101。分别用转化pGD-P、pGD的农杆菌浸润接种五叶期本氏烟，6d后选取分别已浸润接种的叶片适量，用包被液将其研磨、离心，取上清以1:100稀释作为包被原；以1:8000倍稀释的P蛋白为阳性对照，健康本氏烟汁液为阴性对照；以所制备的P蛋白单抗为一抗；采用id-ELISAELISA检测在烟草中表达的P蛋白。试验结果表明所制备的单抗可以成功地用于检测在烟草中表达的P蛋白，见表1。

表1细胞株4D1单克隆抗体检测在烟草中表达的P蛋白