离子交换过程中界面上蛋白质结构及动态变化

摘要

层析技术是蛋白质分离纯化最为有效的手段之一，可在相对温和的条件下获得高纯度目标产物。蛋白质在界面上的吸附与解吸（洗脱）过程是层析分离的基础，但是由于蛋白质结构复杂且受介质性质和溶液环境等多种因素的影响，在层析过程中易出现蛋白质亚基的解离、多肽链破坏和蛋白质失活等问题。本文采用不同种类的氨基硅烷对硅片和双偏振干涉测量仪(DPI)的芯片进行修饰，以牛血清白蛋白（BSA）和免疫球蛋白(IgG)为模型蛋白质，借助双偏振干涉测量仪考察了层析过程中界面上蛋白质结构及动态变化，主要结果如下：
　　1、首先用三种氨基硅烷对硅片进行修饰，并分别用X射线光电子能谱仪、接触角测量仪和原子力显微镜对其表面元素组成、亲疏水性和形貌进行表征，三种氨基硅烷分别为：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane,APTES）、3-(甲氨基)丙基三甲氧基硅烷（(3-methylaminopropyl)trimethoxysilane,MAPTMS和N,N-二乙基-3-氨基丙基三甲氧基硅烷((3-diethylaminopropyl)trimethoxysilane,DAPTMS)。结果表明，经修饰后的硅片表面出现氮元素，对信号峰出现位置分析修饰后硅片表面物质含有C-C键、C-N键和Si-O键。修饰前硅片表面的接触角是28.4°，经APTES、MAPTMS和DAPTMS修饰后硅片的接触角分别为42.7°、52.2°和53.4°，修饰前后的界面亲疏水性发生明显变化，进一步证明氨基硅烷被偶联在硅片表面。用原子力显微镜（AFM）对修饰前后硅片表面进行扫描，氨基硅烷修饰后，硅片表面在形貌、厚度和粗糙度等方面存在显著差异。
　　2、采用DPI考察了BSA在三种氨基硅烷修饰的芯片表面的吸附及洗脱行为。BSA在APTES修饰的芯片界面上吸附层厚度为1.18nm，发生了多位点吸附，构象变化较大，而且难洗脱。在相同的偶联密度条件下，DAPTMS修饰的DPI芯片上BSA吸附量为1.10ng/mm2，高于MAPTMS修饰的芯片，但吸附层厚度基本相同，表明DAPTMS修饰后的芯片上BSA吸附层密度较高。用原子力显微镜对吸附在芯片表面的蛋白质进行扫描，其扫描结果与DPI分析结果一致，证明了配基密度和种类不仅影响界面上蛋白质吸附量，而且影响蛋白质吸附密度和表面聚集行为。
　　3、采用DPI考察了不同浓度的BSA在DAPTMS修饰的芯片上的吸附行为，结果表明，三种浓度的BSA在界面上的吸附层厚度和质量随时间的变化趋势基本一致，而且达到吸附平衡时，吸附层厚度在3.50-4.00nm之间，吸附质量介于1.28-1.42ng/mm2之间，表明蛋白质在界面上形成了多圈的结构。
　　4、采用DPI考察了IgG在三种氨基硅烷修饰芯片表面的吸附和洗脱行为，结果表明，IgG在APTES和DAPTMS修饰芯片表面的吸附层厚度均为4.16nm，吸附质量分别为1.25ng/mm2，1.23ng/mm2，在MAPTMS修饰芯片表面的吸附层厚度和质量分别为1.00nm，0.45ng/mm2。与BSA在三种界面上的吸附存在差异，说明蛋白质种类和分子大小都影响其在界面吸附和洗脱。
　　本研究对于新型层析介质的研制，以及深入理解蛋白质在介质表面上的失活机理具有一定的理论意义和使用价值。

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缩略词表

第1章 绪论

1.1层析技术概述

1.2蛋白质在固相界面上的吸附研究现状

1.3蛋白质界面吸附行为的研究方法及进展

1.4本课题的研究意义与研究内容

第2章 材料与方法

2.1材料和仪器

2.2方法

第3章 硅片表面不同种类氨基硅烷修饰及表征

3.1引言

3.2硅片预处理

3.3硅片表面不同种类氨基硅烷修饰

3.4不同种类氨基硅烷修饰硅片的表征

3.5小结

第4章 牛血清白蛋白在界面上的动态变化

4.1引言

4.2牛血清白蛋白在三种氨基硅烷修饰界面上的动态变化

4.3 小结

第5章 免疫球蛋白在界面上的动态变化

5.1引言

5.2免疫球蛋白在三种界面上的动态变化

5.5蛋白质在界面上洗脱行为比较

5.6小结

第6章 结论与展望

6.1结论

6.2创新点

6.3展望

参考文献

致谢

作 者 简 介

石河子大学硕士研究生学位论文