单增李斯特菌LM90侵染人/鼠脑微血管内皮细胞cDNA文库构建

摘要

单核细胞增多性李斯特菌(listeria monocytogenes, LM)是重要的食源性胞内致病菌,临床主要引起脑膜炎,脑膜脑炎,围产期母畜和胎儿感染。该病的发生主要是源于该菌能穿过动物三大屏障:肠道屏障、血脑屏障、血胎屏障。LM可以跨越血脑屏障中主要组成结构—脑微血管内皮细胞间紧密连接,表明LM表面存在着不同的配体,这些配体可以与内皮细胞上受体相结合,进而使其进入宿主细胞内与细胞内的蛋白相互作用。为了筛选与LM表面蛋白相互作用的宿主内皮细胞蛋白,本研究以人脑微血管内皮细胞(原代)、鼠脑微血管内皮细胞(传代)为体外血脑屏障模型,通过LM侵染上述细胞建立cDNA文库,为酵母双杂交的筛选奠定基础。
　　1.李斯特菌的PCR检测:根据已公布李斯特菌各菌种保守基因Iap和lmo0038的核苷酸序列,合成了能够区分李斯特菌不同种的特异性引物,对实验室保存的菌种进行PCR的验证,本试验中李斯特菌各菌株的PCR鉴定结果为:种1、种2、种3扩增出1108bp特异性条带,确定为塞氏李斯特菌,种5、干粉3、干粉4扩增出720bp和403bp特异性条带,确定单核细胞增多性李斯特菌。
　　2.LM对人/鼠脑微血管内皮细胞黏附、侵袭及胞内增殖试验:用单增李斯特菌LM90、LM3(干粉3)、LM4(干粉4),塞氏李斯特菌(LS,种2),无害李斯特菌(ATCC33090)感染脑微血管内皮细胞,采用BHI平板计数,测定细菌黏附率、侵袭率及不同时间细胞内增殖情况。试验结果表明:LM90、LM3、LM4对脑微血管内皮细胞黏附率3.04％~7.83%,统计学分析差异不显著;LM90、LM3、LM4、对人/鼠脑微血管内皮细胞侵袭率(0.036%~0.128%)均大于L.seeligeri(0.0315%、0.00148%),L.innocua则不侵袭脑微血管内皮细胞。LM90、LM3、LM4对人/鼠两种细胞的侵袭率存在显著差异(P<0.05),同一细菌在不同脑血管内皮细胞中出现最高菌量及时间有差异,临床分离株LM90增殖速度及菌量明显高于其它菌株。LM不同菌株粘附和侵袭不同脑微血管内皮细胞以及在其中增殖的速率存在差异。
　　3.LM90侵染脑微血管内皮细胞cDNA文库构建:用单增李斯特菌LM90株以100:l(细菌:细胞)的个数比,侵染人/鼠脑微血管内皮细胞0.5h、1h、2h、3h、4h后提取RNA,通过RT-PCR扩增mRNA,PCR产物与捕获载体经过sfiI酶切后连接,转化大肠杆菌,构建LM侵染的人/鼠脑微血管内皮细胞的cDNA文库,并对文库中的部分克隆进行测序。试验结果表明,构建的LM90侵染鼠脑微血管内皮细胞cDNA文库中,共获得1.2×105个转化子,阳性重组率为97.92%,1kb-2kb之间片段约占22.9%,0.5kb-1kb之间片段约占70.83%,0.5kb以上片段约占93.75%,测序基因功能涉及钙离子结合、受体信号激活等;构建的LM90侵染人脑微血管内皮细胞 cDNA文库中,共获得1.03×105个转化子,阳性重组率为87.5%,1kb-1.5kb之间片段约占7.14%,0.5kb-1kb之间片段约占71.42%,0.5kb以上片段约占78.57%,所测序列功能包含mRNA结合分子、骨架系统发育等。

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前言

第一章 文献综述

1.李斯特菌病概述

2.李斯特菌病原学特征

3．LM致病机理及侵染细胞毒力因子

4.血脑屏障(BBB)及体外血脑屏障建立方法

5 cDNA文库概述

第二章 试验部分试验一 李斯特菌PCR验证

1材料与试剂

2.方法

3 结果

4讨论

试验二 LM对人／鼠脑微血管内皮细胞黏附、侵袭及胞内增殖试验

1材料

2方法

3结果

4 分析与讨论

试验三 单增李斯特菌LM90侵染脑微血管内皮细胞cDNA文库构建

1材料

2方法

3结果

4分析与讨论

第三章 结论

创 新 点

参考文献(Reference)

致谢

作 者 简 介

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