金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗特异表达基因筛选与体内定殖阶段cDNA文库构建

摘要

金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类重要的昆虫病原真菌，在害虫生物防治中起着重要作用。与化学农药相比，昆虫病原真菌开发的真菌杀虫剂作用时间持久、无环境污染、对非靶标生物安全，但存在致死时间长，杀虫效率低，防效不稳定等缺点，严重阻碍了真菌杀虫剂的广泛应用，为解决这一问题，在分子水平上揭示昆虫病原真菌致病机理尤为重要。金龟子绿僵菌侵染寄主昆虫时，分生孢子在体表萌发形成附着胞，并分泌多种蛋白酶类降解昆虫体壁，附着胞的形成与分化在侵染过程中发挥着重要作用。金龟子绿僵菌直接穿透寄主体壁进入体内，在血淋巴定殖，以掠夺寄主营养或分泌毒素使寄主死亡，能否在体内成功定殖决定着侵染的最终结果。筛选附着孢形成时期和血淋巴定殖阶段的特异表达基因和基因表达特征分析，对于研究昆虫病原真菌致病机理具有重要意义。
　　 EST序列分析和微阵列技术是研究昆虫病原真菌致病机理的成功策略，国内外许多研究者通过这种策略对绿僵菌侵染昆虫致病机理进行了深入研究，但采用的方法均是离体条件下，在各种液体培养基中加入诱导物培养，然后构建绿僵菌cDNA文库，大规模测序，进行EST序列分析。很明显，这些技术路线有一定的局限性，绿僵菌在离体液体培养环境下处于腐生生长阶段，而绿僵菌侵染昆虫过程属于寄生生活阶段，离体条件下诱导培养和事实的侵染过程差别明显，很难对绿僵菌穿透寄主体壁机制，定殖寄主血淋巴适应机制作出完整的诠释，从而阐明病原真菌和寄主的相互作用关系。
　　 本研究以金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株CQMa102和东亚飞蝗(Locusta migratoria)为研究对象，从寄主血淋巴中分离出无寄主核酸污染的绿僵菌菌体，以已降解寄主核酸的东亚飞蝗翅膀诱导附着孢形成与分化，利用抑制消减杂交技术(SSH)筛选绿僵菌在附着胞形成时期和定殖血淋巴阶段的特异表达基因。DSN均一化和SMART技术相结合构建了金龟子绿僵菌CQMa102定殖东亚飞蝗血淋巴阶段的全长均一化cDNA文库，大规模测序，进行EST序列分析，分析绿僵菌定殖寄主血淋巴阶段的基因表达特征，以阐明寄主和病原物之间的相互作用关系。
　　 主要研究结果如下：
　　 1.观察了金龟子绿僵菌CQMa102在实验条件下侵染东亚飞蝗的致病过程：发现24h左右分生孢子穿透寄主表皮进入血淋巴，接触血细胞，引起血细胞聚集；3天～6天大量的芽生孢子被血细胞吞噬、包囊；在寄主昆虫死亡前24 h左右，各种血细胞数量急剧减少，芽生孢子开始迅速繁殖，血淋巴内悬浮着大量酵母状虫菌体(hyphal body)。
　　 2.根据寄主血细胞和病原真菌细胞结构差别，建立和完善了利用蛋白酶K和SDS迅速裂解寄主血细胞的方法，整个流程时间约40 min，RT-PCR检测表明，利用寄主血细胞裂解释放的内源性RNases和后续PBS洗涤可高效去除血淋巴分离绿僵菌菌体中的寄主核酸污染，这一结论也被后续EST序列分析所证明。
　　 3.以寄主体内分离，去除寄主核酸污染的绿僵菌菌体提取mRNA为实验组(tester)，用RNA fragmentation buffer处理东亚飞蝗翅膀，降解寄主核酸，并诱导附着孢形成与分化，以该时期的菌体提取mRNA为驱动组(driver)，进行抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)，筛选出350个阳性克隆，测序，获得的EST序列经聚类分析、共拼接成120 unique ESTs，其中100条singletons，20条contigs，经基因注释和功能分类，29条(24.17％)ESTs和NR数据库有同源性，其功能参与各种细胞代谢和应答过程，包括细胞代谢、蛋白代谢、细胞结构与功能以及参与胁迫和抵抗等生物学过程。
　　 4.为验证消减效率，随机选择5个预测基因，以半定量RT-PCR分析了在绿僵菌侵染东亚飞蝗不同阶段的表达水平，包括碗豆素脱甲基酶(pisatin demethylase)基因(Mpdl)，α-烯醇化酶(α-enolase)基因(Mel)，异戊烯基转移酶(prenyltransferase)基因(Mpt)，α-1，2甘露糖基转移酶(α-1，2-mannosyltransferase)基因(Mmntl)，胆碱脱氢酶(cholin dehydrogenase)基因(Mcd)。结果表明5个基因均在定殖寄主血淋巴阶段有较高的表达量。
　　 5.为筛选附着孢形成阶段特异表达或上调表达基因，以无寄主核酸污染的蝗虫翅膀诱导附着孢形成，提取mRNA为实验组(tester)，以去除寄主核酸污染的血淋巴分离绿僵菌菌体提取mRNA为驱动组(driver)，消减杂交筛选出460个阳性克隆，测序，获得329条高质量ESTs，聚类分析、拼接成78 unique ESTs。其中46条ESTs与数据库中已知蛋白序列有明显的同源性，24条己知功能的同源ESTs涉及多种代谢和应答过程，包括细胞代谢、蛋白代谢、细胞结构与功能以及胁迫和抵抗等生物学过程。
　　 6.随机选择12条ESTs，分别提取绿僵菌在蝗虫翅膀生长8 h、15 h、24 h、30 h，以及体内定殖阶段(第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天)血淋巴的总RNA，DNase I处理后，以3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(G3pdh)为参照基因，进行半定量分析，结果表明12条ESTs均在附着孢形成时期上调表达。
　　 7.DSN均一化和SMART技术相结合构建了金龟子绿僵菌CQMa102定殖东亚飞蝗血淋巴阶段的全长均一化cDNA文库，并对整个文库进行了EST序列测定，共挑取5222个克隆进行测序，获高质量ESTs4606条，聚类、拼接成1863个unique ESTs，其中1237条singletons，626条contigs。经基因注释和功能分类，同源ESTs涉及基础代谢，能量产生，维持细胞功能与结构，调节细胞周期、分裂或生长，对抗胁迫及防御等各种生物学功能。
　　 8.利用SMART技术构建了金龟子绿僵菌CQMa102定殖东亚飞蝗血淋巴时期的全长cDNA文库，挑克隆，测序获得187条unigenes，这些ESTs均是绿僵菌定殖寄主血淋巴阶段的高丰度表达基因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词

声明

1绪论

1.1引言

1.2昆虫病原真菌的侵染过程

1.3绿僵菌的侵染机理研究进展

1.3.1绿僵菌对寄主的识别与粘附

1.3.2绿僵菌侵染寄主过程中附着胞形成

1.3.3绿僵菌对寄主体壁的穿透机制

1.3.4绿僵菌进入寄主血淋巴后的适应机制

1.4寄主对昆虫病原真菌的防御

1.4.1寄主表皮对昆虫病原真菌的阻抑作用

1.4.2昆虫的先天免疫系统对昆虫病原真菌的识别与防御

1.5抑制性消减杂交技术(SSH)

1.5.1 SSH的原理及应用

1.5.2 SSH技术评价

1.6均一化技术

1.6.1常用的均一化技术

1.6.2基于DSN的均一化技术

1.7立题依据

1.8研究内容和技术路线

1.8.1研究内容

1.8.2技术路线

1.9本研究的创新点

2快速从感病寄主血淋巴中分离病原物菌体方法的建立

2.1引言

2.1.1从寄主血淋巴中分离病原物菌体的目的及意义

2.2材料与方法

2.2.1实验菌株及培养基

2.2.2主要仪器设备

2.2.3主要溶液及配制

2.2.4东亚飞蝗总RNA的提取

2.2.5绿僵菌总RNA的提取

2.2.6东亚飞蝗血淋巴的收集

2.2.7东亚飞蝗血淋巴中绿僵菌菌丝体的快速分离

2.2.8寄主血淋巴中分离菌丝体mRNA的提取

2.2.9寄主特异检测引物设计和反转录体系构建

2.3结果与分析

2.3.1细胞裂解液对寄主血淋巴中虫菌体的影响

2.3.2 cDNA中寄主核酸的检测

2.4讨论

2.4.1寄主血淋巴中菌体分离技术的设计

2.4.2寄主核酸的降解

3利用抑制性消减杂交技术筛选绿僵菌定殖寄主血淋巴阶段特异表达基因

3.1引言

3.1.1筛选定殖寄主血淋巴阶段特异表达基因的目的与意义

3.1.2克隆定殖寄主血淋巴阶段特异表达基因方法选择

3.2材料与方法

3.2.1供试菌株

3.2.2主要仪器设备

3.2.3主要试剂

3.2.4培养基及部分储液配方

3.2.5供试菌株培养及分生孢子悬浮液的制备

3.2.6绿僵菌油剂悬浮液接种东亚飞蝗

3.2.7东亚飞蝗血淋巴收集

3.2.8东亚飞蝗血淋巴中病原物菌体的分离

3.2.9寄主血淋巴中分离病原物菌体mRNA的提取

3.2.10寄主血淋巴混合总RNA的提取

3.2.11绿僵菌在附着胞形成时期菌体的获得

3.2.12绿僵菌在附着胞形成时期总RNA的提取

3.2.13 cDNA的合成

3.2.14 Rsa I酶切

3.2.15接头连接和连接效率检测

3.2.16两次差减杂交

3.2.17两次PCR扩增

3.2.18差减产物的克隆和检测

3.2.19阳性克隆的筛选

3.2.20阳性克隆的测序和EST序列分析

3.2.21感受态细胞的制备和电转化

3.2.23半定量RT-PCR分析特异表达基因在侵染不同时期的表达水平

3.3结果和分析

3.3.1绿僵菌穿透表皮，进入寄主血淋巴后不同时期的状态

3.3.2 mRNA质量检测和cDNA合成

3.3.3酶切效率检测

3.3.4连接效率检测

3.3.5消减杂交PCR产物分析

3.3.6消减效率检测

3.3.7插入片断大小检测

3.3.8消减文库的筛选

3.3.9测序结果和分析

3.3.10特异表达基因在致病不同阶段的表达变化

3.4讨论

3.4.1抑制消减杂交中tester和driver的选择

3.4.2特异表达基因的功能分析与预测

4利用抑制性消减杂交技术筛选绿僵菌附着孢形成时期特异表达基因

4.1引言

4.1.1筛选附着孢形成时期特异表达基因的目的与意义

4.2材料与方法

4.2.1供试菌株

4.2.2主要仪器设备

4.2.3主要试剂

4.2.4培养基及部分储液配方

4.2.5菌株培养、分生孢子悬浮液的制备和接种

4.2.6东亚飞蝗血淋巴收集，菌丝体分离，mRNA提取

4.2.7绿僵菌在附着胞形成时期菌丝体的获得

4.2.8绿僵菌在附着胞形成时期总RNA的提取

4.2.9消减杂交

4.2.10半定量RT-PCR验证SSH结果

4.3结果和分析

4.3.1试验材料的准备

4.3.2连接效率检测

4.3.3消减效率检测

4.3.4消减杂交PCR产物分析

4.3.5插入片断大小检测

4.3.6消减文库的筛选

4.3.7测序结果和分析

4.3.8 RT-PCR验证结果

4.4讨论

5绿僵菌定殖寄主血淋巴阶段全长均一化文库的构建

5.1引言

5.1.1研究目的与意义

5.1.2均一化cDNA文库构建技术的选择

5.1.3 EST序列分析

5.2材料与方法

5.2.1供试菌株和载体

5.2.2培养基和部分储存液的配制

5.2.3主要仪器

5.2.4.主要试剂

5.2.5供试菌株培养及分生孢子悬浮液的制备

5.2.6绿僵菌接种和染病东亚飞蝗血淋巴的收集

5.2.7东亚飞蝗血淋巴中病原物菌体的分离

5.2.8寄主血淋巴中分离病原物菌体的mRNA提取

5.2.9 cDNA第一链的合成

5.2.10 cDNA第二链的合成

5.2.11全长cDNA的均一化

5.2.1 2均一化效果检测

5.2.13 cDNA片段的酶切和分级分离

5.2.14 cDNA与载体pDNR-lib连接

5.2.15转化

5.2.16文库质量的鉴定

5.2.17序列测定与EST序列分析

5.2.18 pDNR-LIB载体制备

5.3结果和分析

5.3.1 mRNA的分离

5.3.2全长cDNA的合成

5.3.3均一化效果检测

5.3.4文库滴度和插入片断大小分析

5.3.5测序结果分析

5.4讨论

6绿僵菌定殖寄主血淋巴阶段全长cDNA文库的构建

6.1引言

6.2材料与方法

6.2.1供试菌株和载体

6.2.2培养基和部分储存液的配制

6.2.3主要仪器

6.2.4主要试剂

6.2.5供试菌株培养及分生孢子悬浮液的制备

6.2.6东亚飞蝗血淋巴中无寄主核酸污染的菌丝体的获得

6.2.7寄主血淋巴来源的mRNA的获得

6.2.8 cDNA第一链的合成

6.2.9 cDNA文库构建

6.2.10序列测定与EST序列分析

6.3结果与分析

6.3.1 mRNA的分离

6.3.2全长cDNA的合成

6.3.3文厍滴度和插入片段分析

6.3.4 EST序列分析与功能聚类

6.4讨论

7主要结论及后续工作建议

致 谢

参考文献

附 录