中枢神经系统感染和痴呆疾病脑脊液中蛋白组学变化研究

摘要

(一)中枢神经系统炎症和痴呆病脑脊液中蛋白组学变化研究
　　 目的：
　　 检测sCJD病例和对照组各组脑脊液中瓜氨酸化蛋白及其相关作用酶的表达，进一步了解蛋白质瓜氨酸化和神经系统疾病的致病机制，旨在发现一种可能的脑脊液早期标志物来对病例进行干预，通过对活体病例的检测可以监控sCJD病例的发病过程，对sCJD病的早期诊断和干预具有重要的临床意义。另外，本课题还测定了不同神经系统痴呆疾病和中枢神经系统炎症患者脑脊液中PrPc、Aβ42和Tau蛋白的表达，分析其表达量的异同点，以期了解不同神经系统变性疾病发病机制的异同及其和中枢神经系统炎症的关系，对发展新的治疗方法、设计安全有效地治疗具有重要意义。
　　 方法:
　　 本课题采用病例-对照研究，选取已经确诊的sCJD患者的脑脊液和对照组各30例，利用蛋白免疫(Western blot)和二维电泳及质谱鉴定方法及瓜氨酸化抗体来检测各组脑脊液中瓜氨酸化蛋白的表达量，并用免疫荧光双标法检测各组脑组织切片中的瓜氨酸化蛋白定位。另外还选取确诊的AD、sCJD、脑炎和脑膜炎患者脑脊液标本分别17、12、14、15例，采用Western blot法和酶联免疫吸附法(ELISA)，研究和分析脑脊液中PrPc、Aβ42和Tau蛋白的表达，采用SPSS11.5统计软件对所有数据进行统计学分析。
　　 结果：
　　 1.在sCJD组脑脊液中瓜氨酸化蛋白较对照组有明显增加。说明瓜氨酸化蛋白量的异常增加有可能与CJD疾病的致病性相关。
　　 2.相对于对照组，sCJD病例脑脊液中PAD2酶的表达水平和活性显著提高。sCJD病例组较对照组中存在着过表达的瓜氨酸化GFAP蛋白。
　　 3.通过免疫荧光双标法显示在sCJD病例大脑额叶皮质中GFAP蛋白和瓜氨酸化蛋白的共定位，PAD2酶和GFAP蛋白在sCJD病例大脑额叶皮质中共定位。
　　 4.免疫分析结果为sCJD组PrPc的表达量大约为对照组的70％左右，AD组PrPc的表达量也较对照组低，但高于sCJD组，而脑炎和脑膜炎组PrPc的表达量较在上述各组中最低。酶联免疫吸附法结果为PrPc检测值分别为138±75 ng/ml、160±76 ng/ml，正常对照组为225±68 ng/ml。
　　 5.免疫分析结果为sCJD、AD和脑炎及脑膜炎病例脑脊液中Aβ42蛋白的表达量都较对照组下降，其中，sCJD组下降最显著，约为对照组的40％。酶联免疫吸附法Aβ42检测值分别为554±169 pg/ml、339±127 pg/ml，正常对照组为976±125pg/ml。
　　 6.免疫分析结果为sCJD和AD组Tau蛋白含量明显的高于对照组，脑膜炎和脑炎组次之，也不同程度的稍高于对照组。酶联免疫吸附法为sCJD组脑脊液中Tau蛋白(6803±2678 pg/ml)与正常对照组(1074±24 pg/ml)相比，其值超过63倍；而AD组(409±107 pg/ml)也比正常值(107±24 pg/ml)高出3倍多，脑炎和脑膜炎组(167±44 ng/ml)则比正常对照组(107±24 pg/ml)高出50％多。
　　 结论：
　　 1.sCJD组脑脊液中瓜氨酸化蛋白较对照组有明显增加，通过2D-电泳和质谱分析确定过表达的瓜氨酸化蛋白为GFAP蛋白，免疫荧光双标实验证实瓜氨酸化GFAP蛋白与瓜氨酸蛋白点共定位。GFAP蛋白的瓜氨酸化可能成为神经系统变性疾病中一种潜在的早期标志物。
　　 2.sCJD病例脑脊液中PAD2酶的表达水平及活性较对照组显著增，其在GFAP蛋白的瓜氨酸化过程发挥着重要作用。
　　 3.钙离子浓度是PAD2酶催化瓜氨酸化过程中的重要调节因素。结合实验结果和文献报道我们认为在sCJD病变时，钙离子升高，高浓度的钙离了激活了PAD2酶，进而导致GFAP蛋白质瓜氨酸化。
　　 4.sCJD组、AD组、脑炎组(脑炎和脑膜炎)PrPc蛋白的表达量较正常对照组低，提示PrPc蛋白在中枢神经系统变性疾病和中枢神经系统炎症病理机制之间起到了桥梁作用。
　　 5.sCJD组、AD组、脑炎组(脑炎和脑膜炎)Aβ42蛋白的表达量均较正常对照组低，反应出Aβ42蛋白可能也与中枢神经系统炎症和神经变性疾病有一定关联。
　　 6.sCJD组、AD组、脑炎组(脑炎和脑膜炎)Tau蛋白的表达量均较正常对照组高，其中sCJD组升高最为显著。
　　 (二)Fe2O3纳米颗粒体外生物毒性效应研究
　　 背景：随着纳米技术的蓬勃发展，纳米技术逐渐延伸到人们的日常生活当中，越来越多的纳米材料进入环境。由于纳米材料特殊的物理化学特性，使其在很多领域具有广泛的应用。近期研究发现纳米技术在生物、医药上也具有巨大的应用潜力，包括疾病诊断、分子成像、生物传感器荧光标识物、药物和基因传输、蛋白质的检测、DNA结构探索、组织工程学等。因此人类暴露于纳米颗粒的途径多种多样：吸入、摄取以及皮肤途径等。一旦进入人体，各种各样的纳米颗粒就会分布到人体的各种器官，甚至可以通过生物屏障。纳米颗粒对环境和包括人在内的生物体的毒性及相容性逐渐引起了人们的高度关注。加强纳米颗粒对生物、环境的毒性效应的研究，可以使人们在充分享受纳米技术带来的优越的同时，尽量避免纳米颗粒的毒性效应对人体的伤害。
　　 目的及方法：铁的氧化物在人们的日常生活中应用非常广泛，一方面其纳米形态可以用在染料、催化、陶瓷、能源转换等不同的领域，与人类的生活和环境的安全密切相关；另一方面作为一种重要的磁性材料在智能靶向治疗和药物载体等医药领域有着广泛的应用价值。其作为药物载体和靶向特性的前提是与生物体具有生物相容性，不能产生明显的毒副作用。
　　 论文本章内容就是通过MTT比色法、乳酸脱氢酶释放法、细胞的脂化过氧化作用检测等方法研究氧化铁纳米颗粒对人体细胞的生物毒性效应和毒理机制，以期达到为纳米颗粒的实际应用提供更多的理论依据的目的。
　　 结果：通过各种实验测试手段我们得到以下结果。氧化铁纳米颗粒对细胞的毒性效应具有剂量和时间特性，大剂量纳米颗粒和长时间暴露于纳米颗粒环境中都可引起严重的生物毒性。不同剂量的氧化铁纳米颗粒作用于Hek-293细胞都可以引起SOD和GSH-Px活性的降低，LDH释放量增加，MDA含量升高。
　　 结论：通过分析我们得到以下主要结论：
　　 1.纳米氧化铁对HEK293细胞表现出剂量和时间特性的生物毒性效应。
　　 2.纳米氧化铁对HEK293细胞的毒性机制主要是活性氧自由基的产生和氧化应激反应介导的纳米颗粒生物毒性。氧化铁纳米颗粒与Hek-293细胞产生作用导致细胞内超氧阴离子(O2·-)羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)等活性氧水平的增加，攻破抗氧化酶、解毒酶等组成抗氧化防御系统，引起细胞膜的破坏和细胞的凋亡。