Syncytin在小鼠失神经支配腓肠肌中的表达

摘要

背景与目的：运动神经元病(motorneurondisease，MND)是一组病因未明的慢性进行性神经系统变性疾病。运动神经元病包括肌萎缩侧索硬化、进行性脊肌萎缩症、原发性侧索硬化和进行性延髓麻痹。其中肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是最常见的运动神经元疾病，大约10％ALS病人为家族型，呈常染色体显性遗传。大约90％为散发型ALS，散发型ALS的发病机理不清。过氧化损伤、谷氨酸的兴奋毒性作用、线粒体功能障碍、蛋白错误折叠、神经细丝的解体和轴突转运障碍、病毒感染机制、中毒机制、自身免疫、环境因素等可能参与ALS的发病。流行病学研究目前提出了环境因素和基因易感性联合导致ALS的假说，其中病毒感染是一个重要的因素。
　　虽然在临床上有证据表明ALS与脊髓灰质炎病毒、肠道病毒及逆转录病毒存在相关性，但是至今仍未能成功地鉴定出一种明确的ALS致病性病毒。近年来报道了ALS病人及与病人有血缘关系的健康对照组血清中存在与外源性逆转录病毒RNA均无同源性的逆转录病毒逆转录酶RNA的表达，推测出ALS患者逆转录酶活性增高可能是源于激活的人基因组上的内源性逆转录病毒(Humanendogenousretroviruses，HERVs)。
　　Oluwole等应用实时PCR检测了MND患者萎缩肌肉、未萎缩肌肉以及正常对照组肌肉组织中位于染色体7q21.2的HERV-Wenv即syncytin基因的表达，结果显示萎缩肌肉组织中syncytinmRNA水平比正常对照肌肉组织显著增高，比未萎缩肌肉组织也有增高。此研究在国际上首次报道了MND组织中syncytin基因的异常转录，但其与MND可能的相关性及意义仍待进一步研究。
　　张伟等采用小鼠坐骨神经横断损伤模型，应用realtimePCR检测神经损伤后7天腓肠肌中syncytinmRNA水平，与对照组间没有显著差异。为了消除手术创伤和神经损伤后急性炎症的影响，本研究采用小鼠坐骨神经横断损伤模型，延长观察时间，检测坐骨神经损伤后14天失神经支配的腓肠肌中syncytin的表达及定位，探讨骨骼肌中syncytin的表达是否与失神经支配相关。
　　材料和方法：昆明鼠30只，随机分为手术组+自身对照组、假手术组、正常组，每组10只，制备左侧坐骨神经横断损伤动物模型。
　　方法：1、术前及术后1、5、9、13天测量小鼠双下肢行走两侧足间距距离。
　　2、术后第14天，取材小鼠腓肠肌肌肉样本，手术组动物分别取材左侧(手术侧)腓肠肌和右侧腓肠肌，右侧腓肠肌作为自身对照组，假手术组动物取材左侧(假手术侧)腓肠肌，正常对照组取材左侧腓肠肌。每个腓肠肌标本平均分为三份，分别提取总RNA、总蛋白和进行免疫荧光染色。
　　3、应用实时荧光定量RT-PCR检测腓肠肌中syncytinmRNA的水平，以β-actinmRNA水平为内参。
　　4、应用western-blot检测腓肠肌中syncytin蛋白的水平，以GAPDH蛋白水平为内参。
　　5、腓肠肌进行石蜡包埋、切片，应用荧光免疫组化的方法检测syncytin在骨骼肌中的表达部位。
　　实验结果：1、术前与术后第1天，手术组、假手术组小鼠两侧足趾间距无显著差异(均P>0.05)。术后5、9、13天，手术组小鼠两侧足趾间距比假手术组小鼠显著缩短(均P<0.05)。
　　2、术后14天，手术组小鼠手术侧腓肠肌syncytinmRNA水平比手术组自身对照组、假手术组、正常组腓肠肌syncytinmRNA水平显著增高(均P<0.05)。
　　3、术后14天，手术组小鼠手术侧腓肠肌syncytin蛋白水平比手术组自身对照组、假手术组、正常组腓肠肌syncytin蛋白水平显著增高(均P<0.05)。
　　4、腓肠肌石蜡切片免疫荧光染色可见syncytin位于骨骼肌细胞膜。
　　结论：坐骨神经横断损伤后，小鼠运动功能明显受损。坐骨神经损伤后14天在失神经支配的腓肠肌中内源性逆转录病毒膜蛋白syncytinmRNA及蛋白水平显著增高。免疫荧光组化染色显示syncytin在骨骼肌细胞膜阳性表达。结果提示坐骨神经损伤导致骨骼肌失神经支配影响内源性逆转录病毒膜蛋白syncytin在骨骼肌中的表达。这无疑增加了深入研究syncytin异常表达在神经损伤中的病理生理学作用的意义。