人源GPCRs表达筛选和LPAR5、NTSR2的表达纯化与晶体生长尝试

摘要

GPCRs是一类与G蛋白相连接的跨膜蛋白受体家族，具有7个跨膜螺旋，是体内最大的膜受体蛋白家族，该家族受体成员数目已经超过800个。它们广泛参与各种生命活动、生理过程的调节。随着对各种人类疾病分子机制的了解越来越清楚，发现GPCRs还涉及很多重要疾病的发生、发展，与疾病治疗密切相关。GPCRs的结构特征使其在信号传导系统中发挥重要作用，这为GPCRs成为很好的药物靶标提供可能。
　　LPAR5和NTSR2蛋白分别属于A类GPCRs的α，β亚群，由七次跨膜α—螺旋、N端胞外段和C端胞内段组成，它们可以识别并结合细胞外部环境中的信号分子，通过多种信号转导系统将胞外信号传递到细胞内的下游效应分子，引起细胞内的—系列生理生化反应。目前还没有LPAR5和NTSR2蛋白及其复合物的三维结构，我们对LPAR5和NTSR2蛋白的结构与功能、信号通路及其调控机制等的了解还很不清楚，其生物学功能仍不明确。
　　本论文包括两方面工作，前期工作是对人源GPCRs进行表达筛选，包括14种人源GPCRs进行克隆构建、试表达Western Blot检测和小量表达的纯化。从中筛选到表达较好的LPAR5和NTSR2两个蛋白。后期工作主要针对LPAR5和NTSR2蛋白进行克隆、表达、纯化。克隆构建包括突变体、融合蛋白（Bril或T4L）和截短体这些方面的工作，获得了LPAR5和NTSR2共33种亚克隆构建体蛋白。所有构建蛋白均进行小量表达和纯化获得有活性的蛋白，采用HPLC检测蛋白的均一性。实验结果:NTSR2-F347A、NTSR2-1-B-410和NTSR2-1-B-384三个克隆可以看到单体峰，但还存在很大部分的寡聚峰。通过Thermofluor检测蛋白的热稳定性，结果表明蛋白的热稳定性一般，需要继续优化改善。对NTSR2-1-B-384进行了大量表达纯化，获得活性蛋白尝试LCP结晶。同时对已获得较好性质的蛋白继续进行优化构建，将寡聚峰全转变为单体峰，增加表达量，热稳定性好（Tm约为60℃），获得更好性质的蛋白进行LCP结晶实验。本文为人源LPAR5和NTSR2蛋白的结构研究奠定基础，对进一步揭示这两种蛋白参与和行使功能的分子机理信息具有重要意义，及在此基础上的新配体发现研究对药物靶标的发现和新药设计意义重大。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章 GPCRs研究背景

第一节 GPCRs研究综述

1．1．1 G蛋白的结构与分类

1．1．2 GPCRs的结构与分类

1．1．3 GPCRs的配体与功能

1．1．4 GPCRs主要的信号转导通路

1．1．5 GPCRs与疾病的关系

1．1．6 GPCRs的研究现状

第二节 人源LPAR5的研究进展

1．2．1 溶血磷脂酸(LPA)

1．2．2 溶血磷脂酸受体(LPAR)

第三节 人源NTSR2的研究进展

1．3．1 神经降压素(NTS)

1．3．2 神经降压素受体(NTSR)

第二章 实验原理和方法

第一节 基本实验原理

2．1．1 分子克隆技术

2．1．2 蛋白表达系统

2．1．3 膜蛋白分离纯化

2．1．4 膜蛋白结晶

第二节 实验仪器和材料

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验材料

2．2．3 主要实验试剂的配制

第三节 实验方法

2．3．1 分子克隆

2．3．2 昆虫表达系统的Bacmid制备

2．3．3 昆虫细胞培养

2．3．4 Bac-to-Bac杆状病毒表达系统

2．3．5 蛋白质表达检测方法

2．3．6 蛋白质的均一性和热稳定性检测方法

第三章 人源GPCRs表达筛选

第一节 基本特征

第二节 分子克隆

第三节 蛋白的表达和纯化

第四章 人源LPAR5和NTSR2的分子克隆、表达和纯化

第一节 人源LPAR5突变体的克隆、表达和纯化

4．1．1 人源LPAR5的序列生化性质分析

4．1．2 克隆构建

4．1．3 表达纯化

第二节 人源NTSR2突变体的克隆、表达和纯化

第三节 人源NTSR2融合蛋白和截短体的克隆、表达、纯化和结晶

全文总结

参考文献

致谢

个人简历