公开/公告号CN102660524A
专利类型发明专利
公开/公告日2012-09-12
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申请/专利权人 海南华研生物科技有限公司;
申请/专利号CN201210141391.X
申请日2012-05-09
分类号C12N9/64;C12N15/63;C12N15/66;C12N1/19;C12R1/84;
代理机构
代理人
地址 570102 海南省海口市龙华区义龙西路21号侨汇大厦15楼
入库时间 2023-12-18 06:28:50
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2023-04-25
专利权质押合同登记的生效 IPC(主分类):C12N 9/64 专利号:ZL201210141391X 登记号:Y2023980037450 登记生效日:20230407 出质人:海南华研胶原科技股份有限公司 质权人:中国农业银行股份有限公司海口龙华支行 发明名称:高表达高比活皮蝇胶原酶突变体序列、毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法 申请日:20120509 授权公告日:20130220
专利权质押合同登记的生效、变更及注销
2023-04-18
专利权质押合同登记的注销 IPC(主分类):C12N 9/64 授权公告日:20130220 申请日:20120509 专利号:ZL201210141391X 登记号:Y2022460000001 出质人:海南华研胶原科技股份有限公司 质权人:中国农业银行股份有限公司海口龙华支行 解除日:20230330
专利权质押合同登记的生效、变更及注销
2022-04-26
专利权质押合同登记的生效 IPC(主分类):C12N 9/64 专利号:ZL201210141391X 登记号:Y2022460000001 登记生效日:20220408 出质人:海南华研胶原科技股份有限公司 质权人:中国农业银行股份有限公司海口龙华支行 发明名称:高表达高比活皮蝇胶原酶突变体序列、毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法 申请日:20120509 授权公告日:20130220
专利权质押合同登记的生效、变更及注销
2022-04-22
专利权质押合同登记的注销 IPC(主分类):C12N 9/64 授权公告日:20130220 申请日:20120509 专利号:ZL201210141391X 登记号:Y2021980002334 出质人:海南华研胶原科技股份有限公司 质权人:中国农业银行股份有限公司海口龙华支行 解除日:20220406
专利权质押合同登记的生效、变更及注销
2013-02-20
授权
授权
2012-11-07
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N9/64 申请日:20120509
实质审查的生效
2012-09-12
公开
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技术领域
本发明涉及具有高比活皮蝇胶原酶(Hl Collagenase) 序列的确认、该序列毕赤酵母表达载体的构建、分泌表达皮蝇胶原酶的毕赤酵母菌株Hl Collagenase-m/ pGAPZα-A/GS115构建的关键技术、构建结果及利用它来生产高活性皮蝇胶原酶的纯化方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术
胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶(Collagenase),它能在生理PH和温度条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构,而不损伤其它蛋白质和组织。来自梭菌的胶原酶,切割胶原蛋白中甘氨酸残基的氨基端肽键。而来自皮蝇(Hypoderma lineatum)幼虫的胶原酶,切割天然胶原蛋白丙氨酸残基的氨基端肽键。目前医疗上广泛使用的胶原酶是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的,主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。而来自皮蝇幼虫的胶原酶,由于幼虫体内含量低,提取工艺复杂,生产成本高,至今无法大量生产,阻碍了皮蝇胶原酶的推广使用。
发明内容
皮蝇胶原酶是皮蝇一期幼虫可溶性抗原的主要成分,是一种丝氨酸蛋白酶,分子量为25223道尔顿,成熟的皮蝇胶原酶含有230个氨基酸,比其前体少了30个氨基酸,整个氨基酸序列和胰蛋白酶家族的丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列具有高度的相似性。其活性功能片段为45~180位氨基酸,底物结合区是174~201位氨基酸;全序列共有6个半胱氨酸(30,46;151,166;176,204位氨基酸),形成3对二硫键。根据对皮蝇胶原酶分子结构及序列的分析,我们设计切除1~27位的氨基酸序列,使功能区域更大范围地暴露,使之能够更好的和反应底物结合,从而提高酶的活性。并将第29位的色氨酸(Trp)突变为异亮氨酸(Ile),以保持分子结构的稳定性;
具有高活性的皮蝇胶原酶突变体序列如下:
ValIleCysGlyGlySerLeuIleAspAsnLysTrpIleLeuThrAlaAlaHisCysValHisAspAlaValSerValValValTyrLeuGlySerAlaValGlnTyrGluGlyGluAlaValValAsnSerGluArgIleIleSerHisSerMetPheAsnProAspThrTyrLeuAsnAspValAlaLeuIleLysIleProHisValGluTyrThrAspAsnIleGlnProIleArgLeuProSerGlyGluGluLeuAsnAsnLysPheGluAsnIleTrpAlaThrValSerGlyTrpGlyGlnSerAsnThrAspThrValIleLeuGlnTyrThrTyrAsnLeuValIleAspAsnAspArgCysAlaGlnGluTyrProProGlyIleIleValGluSerThrIleCysGlyAspThrSerAspGlyLysSerProCysPheGlyAspSerGlyGlyProPheValLeuSerAspLysAsnLeuLeuIleGlyValValSerPheValSerGlyAlaGlyCysGluSerGlyLysProValGlyPheSerArgValThrSerTyrMetAspTrpIleGlnGlnAsnThrGlyIleLysPhe
该序列的特点是只保留了成熟皮蝇胶原酶序列中的功能区域和底物结合区(28~230位氨基酸)并将29位的色氨酸点突变为亮氨酸,这种改变在理论上使功能区域更大范围地暴露,使之能够更好的和反应底物结合,从而提高酶的活性;
同时,本发明采用毕赤酵母分泌表达系统,该系统产量高、生产成本低兼有真核表达系统翻译后修饰功能等优点,可以用于大量生产皮蝇胶原酶,降低生产成本;
皮蝇胶原酶毕赤酵母重组菌株的构建方法为:将修饰突变的皮蝇胶原酶Hl Collagenase基因插入pGAPZα-A空载体的GAP启动子/α-factor信号肽下游位点,并删除载体上的Kex2位点Lys-Arg之后的Ste13位点Glu-Ala-Glu-Ala,构建成皮蝇胶原酶基因分泌型表达载体Hl Collagenase-m/ pGAPZα-A;利用电转化的方法将Collagenase-m/ pGAPZα-A载体转化毕赤酵母(Pichia pastoris)的菌株GS115,构建成分泌型表达皮蝇胶原酶突变体的毕赤酵母工程菌株--- Hl Collagenase-m/ pGAPZα-A/GS115;通过抗生素筛选、SDS-PAGE电泳分析及生物比活性测定,获得高表达高活性的皮蝇胶原酶突变体毕赤酵母重组菌株;
上述的毕赤酵母重组菌株目标蛋白:皮蝇胶原酶突变体(Hl Collagenase-m)的表达量达到241毫克/升,比活性为1320国际单位/毫克;目标蛋白皮蝇胶原酶突变体比天然的皮蝇胶原酶比活性高5~6倍,且具有很高的稳定性;
皮蝇胶原酶突变体的纯化方法为:利用获得高表达高活性的皮蝇胶原酶突变体毕赤酵母重组菌株进行发酵,离心收集上清液,以氢氧化钠调节PH值,过阴离子交换层析柱,收集目标洗脱峰,得到纯度约70%的皮蝇胶原酶突变体粗品,透析除盐,超滤浓缩,过分子筛层析柱,收集目标蛋白,得到纯度大于95%的皮蝇胶原酶突变体蛋白。
【附图说明】
附图为皮蝇胶原酶突变体(Hl Collagenase-m)表达载体构建图
Hl Collagenase-m/ pGAPZα-A表达载体分子大小为3.759kb。其中pGAPZα-A为3.147kb,Hl Collagenase-m为612bp(包含终止子密码);Hl Collagenase-m插入于载体pGAPZα-A第747与824bp(XbaI位点)之间;
pGAPZα-A载体结构为:
磷酸甘油酸脱氢酶基因(GAP)启动子区域:第1-483bp
磷酸甘油酸脱氢酶基因启动子引物位点:第455-476bp
α-交配因子分泌信号肽序列:第493-759bp
α-交配因子分泌信号肽引物位点:第696-716bp
载体多克隆位点:第760-828bp
Myc抗原决定簇包:第827-856bp
3’-乙醇氧化酶1基因引物位点:第974-994bp
乙醇氧化酶1转录终止区域:第593-1233bp
转录延伸因子1启动子区域:第1234-1644bp
合成原核启动子:第1645-1712bp
链霉菌zeocin抗性基因阅读框:第1713-2087bp
细胞色素合成酶1转录终止区域:第2088-2405bp
大肠杆菌复制子1(来源于pUC载体):第2416-3089bp。
【具体实施方式】
下面结合实施例详细介绍本发明在皮蝇胶原酶突变体重组毕赤酵母工程菌株的构建和皮蝇胶原酶突变体纯化工艺中的具体应用;
实施例1
皮蝇胶原酶突变体(Hl Collagenase-m)毕赤酵母工程菌的构建
1、 根据皮蝇胶原酶突变体的氨基酸序列和酵母对密码子的偏好,设计皮蝇胶原酶突变体全核苷酸序列,并在序列两端引入相应的酶切位点XhoI和XbaI,由大连宝生物公司合成该序列;
2、 采用基因克隆技术将皮蝇胶原酶突变体基因经XhoI/XbaI双酶切后插入pGAPZα-A之GAP启动子/α-factor信号肽下游的XhoI/XbaI位点,构建成含α-factor信号肽的分泌型毕赤酵母表达载体;Hl Collagenase-m/ pGAPZα-A表达载体分子大小为3.759kb,其中pGAPZα-A为3.147kb,Hl Collagenase-m为612bp(包含终止子),皮蝇胶原酶突变体插入于载体pGAPZα-A第747bp与824bp(XbaI位点)之间,具体情况见附图;
3、 通过电转化方法,将线性化的Hl Collagenase-m/ pGAPZα-A质粒转入毕赤酵母GS115感受态(购于Invitrogen公司)中,通过zeocin抗生素筛选获得阳性菌株,进一步用PCR和Southern blotting技术鉴定筛选出的阳性菌株,再用SDS-PAGE电泳方法和SDS-PAGE活性测定方法筛选高表达高活性的Hl Collagenase-m/ pGAPZα-A/GS115工程菌株;
实施例2
皮蝇胶原酶突变体的纯化方法
1、 从-80℃种子库中取出Hl Collagenase-m/ pGAPZα-A/GS115工程菌,接种平板,使菌株活化;
2、 从平板中挑单菌落于200毫升YPD+zeocin100毫克/升培养基中,30℃,250转/分钟,培养48小时,此为一级种子液;
3、 吸取100毫升的一级种子液接种于2升的YPD培养基中,30℃,250转/分钟,培养24小时,此为二级种子液;
4、 将2升的二级种子液接种于含40升YPD培养基的发酵罐中,发酵72小时,离心收集发酵上清液,以1摩尔氢氧化钠溶液调节PH8.0-9.0,过DEAE SepharoseFF层析柱,收集0.3摩尔/升氯化钠溶液洗脱峰,透析过夜除盐,此时可得到纯度大约为70%左右的皮蝇胶原酶突变体蛋白粗品,超滤浓缩,过G25层析柱,收集目标蛋白峰,得到纯度大于95%的皮蝇胶原酶突变体蛋白原液,将原液冻干保存。
<110> 海南华研生物科技有限公司
<120>高表达高比活皮蝇胶原酶突变体序列、毕赤酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法
<160> 1
<170> PatentIn Version 2.1
<210> 1
<211> 203
<212>氨基酸
<213> Hypoderma lineatum (early cattle grub)
<220>
<221> misc_difference
<400> 1
Val Ile Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asp Asn Lys Trp Ile Leu Thr Ala
1 5 10 15
Ala His Cys Val His Asp Ala Val Ser Val Val Val Tyr Leu Gly Ser
20 25 30
Ala Val Gln Tyr Glu Gly Glu Ala Val Val Asn Ser Glu Arg Ile Ile
35 40 45
Ser His Ser Met Phe Asn Pro Asp Thr Tyr Leu Asn Asp Val Ala Leu
50 55 60
Ile Lys Ile Pro His Val Glu Tyr Thr Asp Asn Ile Gln Pro Ile Arg
65 70 75 80
Leu Pro Ser Gly Glu Glu Leu Asn Asn Lys Phe Glu Asn Ile Trp Ala
85 90 95
Thr Val Ser Gly Trp Gly Gln Ser Asn Thr Asp Thr Val Ile Leu Gln
100 105 110
Tyr Thr Tyr Asn Leu Val Ile Asp Asn Asp Arg Cys Ala Gln Glu Tyr
115 120 125
Pro Pro Gly Ile Ile Val Glu Ser Thr Ile Cys Gly Asp Thr Ser Asp
130 135 140
Gly Lys Ser Pro Cys Phe Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Leu Ser
145 150 155 160
Asp Lys Asn Leu Leu Ile Gly Val Val Ser Phe Val Ser Gly Ala Gly
165 170 175
Cys Glu Ser Gly Lys Pro Val Gly Phe Ser Arg Val Thr Ser Tyr Met
180 185 190
Asp Trp Ile Gln Gln Asn Thr Gly Ile Lys Phe
195 200 203
机译: 分离和突变的Polipeptu的核酸序列,核酸表达重组载体的构建,重组宿主细胞。产生突变核酸序列的方法,以产生Polipeptu,然后从细胞中产生突变体。产生蛋白和细胞突变体。
机译: 具有高亲和力的重组人白细胞介素4突变体拮抗剂,药物组合物,多核苷酸序列,不能成为完整生物体的宿主细胞,AN表达载体和实现突变体拮抗剂表达载体以表达重组人il-4的方法。
机译: 高比活性重组S-腺苷高半胱氨酸酶(SAHH)的高表达和生产以及S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的改进测定