人源TRIM2和结核分枝杆菌TreS的表达纯化和晶体生长

摘要

TRIM(TripartiteMotif)蛋白家族（或者称为RBCC家族）是一类含有RING(R)、B-box以及Coiled-Coil区的多结构域蛋白，它不仅参与细胞生长、发育，并与各种人类疾病（癌症、遗传病）以及抗病毒感染等密切相关。TRIM家族蛋白内部结构元件的排列顺序（R-B-CC-Cterm）的一致性揭示了它是通过整体结构行使功能。TRIM2蛋白由RING、B-box、Coiled-coil区和NHL四个结构域组成，在神经系统中高度表达并与神经元活动密切相关。TRIM2的N端的RING结构域具有泛素连接酶的活性，通过结合并泛素化神经纤维轻亚基(NF-L)来调节其代谢。其C端的NHL结构域参与了与非常规动力蛋白myosinV的相互作用。TRIM2的错义突变或者功能缺失将导致NF-L在轴突的堆积，形成神经组织的肿胀，进而引起神经退行性病变。本文主要对TRIM2的全长及各个截短片段进行了克隆构建和蛋白的纯化，并进行晶体的生长尝试，获得了其中的截短体(320-744aa)酶解后的晶体和初步的衍射数据。本文为人源蛋白TRIM2的结构的研究奠定基础，对于进一步揭示该蛋白参与和行使功能的分子机理的信息具有重要意义。
　　 由结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）引起的结核病是目前世界上致死率最高、传播范围最广的细菌性疾病之一。海藻糖合成酶(TrehaloseSynthase，TreS)是催化海藻糖合成通路中的酶，在结核杆菌中主要功能是催化麦芽糖和海藻糖之间的相互转化，同时还可以将糖原转化成为海藻糖。最新研究表明TreS还可以催化海藻糖向α-葡聚糖的转化，这个通路称为结核杆菌的自我毒性通路。为了深入了解结核分枝杆菌中TreS蛋白发挥功能的分子机制，我们采用大肠杆菌表达系统，表达和纯化了TreS重组蛋白。通过Thermofluor实验筛选到有利于蛋白稳定的缓冲液。由于TreS蛋白在纯化过程中聚集状态不均一，我们设计了五个突变体E280A、C251S、C595S、C251S/C595S、C251S/C595S/E280A，表达和纯化获得了较高纯度的突变体蛋白。对重组蛋白和突变体进行结晶尝试后，得到了突变体C251S/C595S的晶体，为TreS蛋白的三维结构的解析，并进而揭示TreS发挥酶活作用的分子机制奠定基础。

目录

声明

摘要

第一部分 人源蛋白TRIM2的表达纯化和晶体生长

第一章 综述

1．1 TRIM家族概述

1．2 TRIM家族三类结构域的功能

1．3 TRIM-NHL家族蛋白

1．4 TRIM2的研究进展

1．5 本课题主要的研究内容

第二章 蛋白质晶体学基础

2．1 概论

2．2 蛋白质的结晶影响因素和方法

2．3 蛋白质结晶条件的筛选

2．4 晶体衍射数据的收集

2．5 晶体结构解析

第三章 人源TRIM2的克隆、表达、纯化和结晶

3．1 人源TRIM2全长的克隆、表达、纯化和结晶

3．2 人源TRIM2(473-744aa)的克隆、表达、纯化和结晶

3．3 人源TRIM2(320-744aa)的克隆、表达、纯化和结晶

第四章 小结

参考文献

第二部分 结核分枝杆菌TreS的克隆、表达、纯化和结晶

第一章 综述

1．1 选题背景及意义

1．2 结核病的药物研究

1．3 海藻糖的研究进展

1．4 海藻糖与结核分枝杆菌

1．5 海藻糖合成酶TreS(Rv0126)的研究进展

1．6 本课题研究目的

第二章 结核杆菌TreS的克隆、表达、纯化和结晶

2．1 结核杆菌TreS的序列分析

2．2 结核杆菌TreS的克隆、表达、纯化

2．3 结核杆菌TreS突变体的克隆、表达和纯化

2．4 结核杆菌TreS的结晶实验

第三章 小结

参考文献

附录

致谢