犬松弛素原多克隆抗体的制备

摘要

松弛素(Relaxin，RLX)是由AB二链构成的短肽链激素，归属于胰岛素家族。松弛素具有广泛的生理功能，包括生殖调控、舒张血管调节血循环、抗炎及促进炎性反应愈合等。目前对松弛素基因的研究主要集中在人、小鼠、猪等物种上，国外已克隆了犬前松弛素原(preprorelaxin)的基因序列，鉴于此，本研究以犬胎盘、卵巢组织为材料，应用RT-PCR技术获得多条犬前松弛素原基因cDNA，进行克隆并作生物信息学分析，同时构建犬松弛素原(prorelaxin)原核表达载体，转化入大肠杆菌中，使其表达相应蛋白质。再将表达的重组蛋白免疫新西兰兔以制备多克隆抗体。上述方法大程度的推动了松弛素的结构和功能的研究。本研究具体如下:
　　1、犬前松弛素原基因的克隆和生物信息学分析
　　本研究以北京犬和吉娃娃新生胎盘、贵宾犬卵巢为材料，采用RT-PCR技术扩增前松弛素原基因，结果显示:本实验完整克隆了从所获样品中扩增到的预期大小目的片段，包含一个534 bp的开放阅读框，编码177个氨基酸。将所扩增片段进行序列分析显示，与NCBI核酸数据库检索的犬preprorelaxin的cDNA序列同源性为99.6％，均有3个核苷酸位点发生改变，从而引起相应氨基酸改变，但并未引起蛋白结构的变化。进化树分析结果显示，所获三条目的片段同为一支，与猫preprorelaxin基因的进化距离最近。生物信息分析显示，3条序列等电点、带电荷数、最高最低氨基酸、消光系数、半衰期、不稳定系数一致，分子式分子量、不稳定系数、脂肪系数、总平均疏水指数有细微差异;跨膜区、信号肽、糖基化位点分析结果一致;二级结构组成一致，包含α-螺旋、延伸链、无规则卷曲，比例存在细微差异。
　　2、犬松弛素原的原核表达及多克隆抗体制备
　　以从北京犬胎盘组织克隆的犬前松弛素原cDNA片段为模板，用特异引物克隆获得松弛素原基因，长度为459 bp，后与带有多聚组氨酸(6×His)的原核表达载体pET28a相连，成功转化入DH5α感受态细胞，经PCR、酶切以及测序鉴定为阳性后，提取pET28a-prorelaxin重组质粒DNA，转化到表达菌BL21(DE3)中表达;利用SDS-PAGE电泳和免疫印迹实验分析菌体裂解液和培养上清液，结果显示目的蛋白以包涵体形式表达，目的蛋白分子量为22kD结果与生物信息学预测结果一致。以诱导表达菌体裂解液纯化蛋白为免疫原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和免疫印迹(Western blotting)对免疫家兔血清进行分析，结果显示血清中犬松弛素原抗体效价达到1∶80000以上，并与松弛素原蛋白发生特异性结合。上述结果表明本试验成获得了犬松弛素原特异性强、效价高的多克隆抗体，为进一步研究犬松弛素原功能奠定了基础。

目录

论文说明

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摘要

英文缩略词表

第一章 文献综述

1 松弛素的生物学特征

1．1 松弛素的分子结构

1．2 松弛素的体内转化过程

2 松弛素的组织来源

3 松弛素的生理功能

3．1 松弛素在卵巢和黄体的作用

3．2 松弛素对子宫、宫颈、内膜、蜕膜的作用

3．3 松弛素对乳房的作用

3．4 松弛素有发动分娩的作用

4 松弛素的孕期变化规律

5 松弛素的体外表达研究现状

6 松弛素的研究目的和意义

第二章 犬前松弛素原基因的克隆及生物信息学分析

1 材料和方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果与分析

2．1 犬前松弛素原基因的RT-PCR扩增

2．2 犬前松弛素原基因重组质粒的鉴定

2．3 犬前松弛素原基因的生物信息学分析

3 讨论

第三章 犬松弛素原基因的原核表达及多克隆抗体制备

1 材料

1．1 实验动物及组织、菌种、表达载体

1．2 主要生物学试剂

1．3 主要溶液的配制

1．4 主要仪器设备

2 方法

2．1 引物的设计与合成

2．2 犬松弛素原原核表达载体的构建

2．3 重组蛋白的诱导表达及纯化

2．4 免疫印迹实验(Western-blotting)

2．5 犬松弛素原多克隆抗体的制备

3 结果

3．1 犬松弛素原基因的克隆及酶切鉴定

3．2 重组松弛素原蛋白的表达和纯化

3．3 抗体效价及抗体特异性检测

4 讨论

结论

参考文献

致谢