辣木叶黄酮提取分离纯化及其主要成分异槲皮苷降血糖活性与机理研究

摘要

糖尿病是一种严重危险人类身心健康的疾病，尽管西药能较好地控制血糖，但存在着各种副作用。大量的天然活性化合物同样也通过各种机制作用于糖尿病，且拥有副作用小，成本低等优势成为研究热点。辣木(Moringa oleifera.Lam)又名鼓槌树(Drumstick tree)，属于热带植物，具有独特经济价值。辣木叶中有大量的生物活性物质，辣木叶黄酮被报道对糖尿病模型小鼠有降低血糖，提高血清SOD，降低MDA的作用。目前还未见辣木叶黄酮降血糖成分及其降糖机理的报道。本论文以辣木叶黄酮为研究对象，系统地研究了其提取、分离和纯化工艺及主要成分异槲皮苷的降血糖活性和机理。本研究的主要内容如下:
　　1、利用响应面法优化微波萃取辣木叶总黄酮工艺。选取乙醇浓度，微波功率，提取时间，液料比为影响因素，总黄酮得率为评价指标。在单因素实验的基础上，通过4因素3水平Box-Behnken中心组合试验建立黄酮得率的二次多项式回归方程，研究以上因素对总黄酮得率的影响。结果表明最佳提取工艺条件为:乙醇浓度58％，微波功率397w，提取时间8min,液料比59∶1，该条件下，模型预测总黄酮得率为3.49％，验证值为3.45％，与其基本相符。
　　2、对辣木叶黄酮的最佳分离纯化条件进行研究并测定了其几种主要成分的含量。HPD-750树脂吸附分离纯化辣木叶黄酮的最佳条件为:在上样液pH6.0条件下，上样浓度为2.5mg/mL的辣木叶黄酮液12mL进行吸附2h，用2BV蒸馏水洗去树脂表面黄酮，3BV70％乙醇可充分洗脱，黄酮回收率最高为85.31％，使黄酮含量由吸附前的15.3％提高到56.7％。通过石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取纯化的辣木叶黄酮，经测定，黄酮类物质几乎全部存在乙酸乙酯部位，其黄酮含量为71.8％。利用反相高效液相色谱法，分别测定了辣木叶粗提黄酮、乙酸乙酯部位、正丁醇部位的异槲皮苷、绿原酸、槲皮素与山奈酚的含量。最终发现，粗提黄酮中的主要成分最终被萃取到乙酸乙酯部位。乙酸乙酯部位所含的异槲皮苷含量最高，为41.42％。由此推断，异槲皮苷是辣木叶黄酮的主要成分。
　　3.对辣木叶黄酮与异槲皮苷进行了体外降糖活性研究。结果表明，两种样品均能在24h内显著促进HepG2细胞对葡萄糖的消耗。辣木叶黄酮在0.156mg/mL浓度时能促进细胞消耗葡萄糖，与空白组对比呈显著差异。异槲皮苷0.031mg/mL浓度下，就能达到相同的显著性，异槲皮苷具有显著的体外降糖效果。最终推断异槲皮苷是辣木叶黄酮中主要的降糖活性成分。
　　4、研究了异槲皮苷的体内降血糖功能。以异槲皮苷10mg·kg-1·d-1、异槲皮苷30 mg·kg-1·d-1、磷酸西格列汀10 mg·kg-1·d-1与生理盐水灌胃高脂高糖与低剂量STZ共同诱导的2型糖尿病模型大鼠21天。对大鼠的各项指标进行测定后，最终发现:异槲皮苷具有改善糖尿病大鼠“三多一少”的症状，降低血糖、改善口服葡萄糖耐受量，提高血清胰岛素与GLP-1含量，降低胰岛素抵抗水平，增加胰岛素敏感性，增强胰岛β细胞功能，减轻氧化应激、抑制炎性反应，且其降低糖尿病心血管疾病风险作用优于磷酸西格列汀。
　　5、观察了异槲皮苷对胰岛β细胞的影响。通过HE染色、醛复红染色对不同用药组大鼠的胰岛进行了观察。结果显示，高剂量异槲皮苷与磷酸西格列汀对胰岛保护的效果较好。在光学显微镜下，胰岛结构较完整，胰岛组织与腺泡界限清晰可见，胰岛细胞数量较多，形态较好，排列整齐，胞浆丰富，胞核多数清晰，仅少量细胞变性或坏死。因此，异槲皮苷对糖尿病大鼠胰岛β细胞有保护作用。
　　6、观察了异槲皮苷对肝脏的影响。利用HE染色观察了各组大鼠的肝脏组织形态变化，用试剂盒测定了肝脏相关血液指标，并以流式细胞术检测了肝脏组织细胞的周期分布与凋亡率。实验结果显示，异槲皮苷具有与磷酸西格列汀相似的作用，能减少肝脏脂肪变性，增加肝脏正常细胞数量，肝索排列整齐，使肝脏组织形态趋于正常;改善糖尿病大鼠脂代谢紊乱，保护肝脏蛋白质合成功能;减少肝脏G0/G1期细胞比例，增加G2+M期比例，抑制肝脏细胞凋亡，促进细胞增殖，改善肝脏病变，恢复肝脏功能。
　　7、研究了异槲皮苷对相关基因表达量的影响。通过荧光定量PCR的检测方法，对糖尿病大鼠肝脏中的几种基因进行了相对表达量测定。结果显示，异槲皮苷的降血糖机理与磷酸西格列汀相似，降低了糖尿病大鼠体内的DPP-4表达量，是一种DPP-4抑制剂;能上调PI3K与Akt的表达量，激活PI3K/Akt通路，对胰岛与肝脏起到抑制凋亡、促进增殖的作用;能上调InsR、PKA、PKCα的表达量，增强机体代谢葡萄糖活性、抑制葡萄糖聚合酶的活性，促进糖原代谢。
　　由以上结果可知，辣木叶黄酮中的异槲皮苷具有降血糖活性，其降血糖机制主要体现在以下几种途径:一是抑制DPP-4的活性，充分发挥机体中GLP-1的作用，刺激胰岛β细胞分泌胰岛素;二是上调InsR的表达量，为胰岛素提供了更多的结合位点，发挥胰岛素降血糖生理作用;三是激活PI3K/Akt通路，上调PKA、PKCα的表达量，对肝脏与胰岛起到抑制凋亡、促进增殖的作用。一方面增强肝脏调节血脂功能，改善高脂对肝脏的损伤，促进糖原代谢;另一方面修复胰岛β细胞，促进胰岛素分泌，增强机体代谢葡萄糖活性。这些效果与异槲皮苷剂量均呈依赖性。在异槲皮苷影响下，机体通过一系列综合调控，使糖尿病大鼠血糖下降。

目录

声明

摘要

常用英文缩写表

第一章 辣木叶的研究进展

1．辣木叶的营养成分

2．辣木叶的主要成分

3．辣木叶的功效

3．1 降血糖

3．2 保护心脏

3．3 保护肝脏

3．4 治疗胃溃疡

3．5 消炎抑菌

3．6 抗癌

3．7 提高免疫力促进生长

3．8 改善胃肠运动功能

4．小结

第二章 DPP4抑制剂的研究进展

1．DPP-4

2．DPP-4抑制剂

3．DPP-4抑制剂的作用

3．1 影响GLP-1

3．2 影响糖代谢

3．3 影响脂代谢

3．4 影响胰腺

3．5 影响免疫

3．6 其他影响

3．7 不良反应

4．小结

第三章 响应面法优化辣木叶总黄酮微波萃取工艺

1．实验材料与仪器

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

2．实验方法

2．1 辣木叶去脂

2．2 标准曲线的建立

2．3 回流提取辣木叶总黄酮及含量测定

2．4 微波萃取辣木叶总黄酮及含量测定

2．5 辣木叶总黄酮得率计算

2．6 响应面法优化实验

2．7 最优工艺检验

3．实验结果

3．1 标准曲线

3．2 回流提取辣木叶黄酮得率

3．3 微波萃取法单因素实验

3．4 响应面分析因素与水平设计

3．5 响应面法对辣木叶总黄酮微波提取工艺参数的优化

4．分析与讨论

4．1 单因素试验

4．2 响应面法对辣木叶总黄酮微波提取工艺参数的优化

4．3 回流提取法与微波萃取法比较

5．小结

第四章 辣木叶总黄酮纯化工艺及几种主要成分含量测定研究

1．实验材料与仪器

1．1 实验材料

1．2．实验仪器

2．实验方法

2．1 辣木叶总黄酮样品的制备

2．2 树脂的预处理与装柱

2．3 大孔吸附树脂的筛选

2．4 HPD-750大孔树脂吸附分离辣木叶黄酮条件优化

2．5 辣木叶黄酮含量的测定

2．6 不同极性部位的分离

2．7 样品中四种成分含量的测定

3 实验结果

3．1 不同大孔树脂静态吸附、解吸辣木叶黄酮性能

3．2 不同大孔树脂对辣木叶黄酮静态吸附及解吸动力学

3．3 HPD-750大孔树脂柱吸附分离辣木叶黄酮条件优化

3．4 HPD-750大孔树脂吸附分离前后辣木叶黄酮含量的测定结果

3．5 不同极性部位的分离

3．6 样品中各种成分含量测定

4．分析与讨论

4．1 不同大孔树脂静态吸附、解吸辣木叶黄酮性能

4．2 HPD-750大孔树脂柱吸附分离辣木叶黄酮条件优化

4．3 不同极性部位的分离

4．4 样品中成分含量测定

5．小结

第五章 辣木叶总黄酮及异槲皮苷的体外降糖活性研究

1．实验材料与仪器

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

2．实验方法

2．1 样品溶液配制

2．2 细胞培养

2．3 HepG2细胞对葡萄糖消耗作用

2．4 MTT毒性试验

3．实验结果

3．1 辣木叶黄酮与异槲皮苷对HepG2细胞增殖的变化

3．2 辣木叶黄酮与异槲皮苷对HepG2细胞葡萄糖消耗的作用

4．讨论

5．小结

第六章 异槲皮苷对STZ诱导糖尿病大鼠血脂血糖的影响

1．实验材料与仪器

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

2．实验方法

2．1 人工诱导2型糖尿病大鼠模型

2．2 异槲皮苷灌胃给药糖尿病模型大鼠

2．3 样本的采集与指标测定

2．4 各项血液指标的测定

2．5 胰岛相关指数计算

2．6 统计学分析

3．实验结果

3．1 大鼠一般情况的观察

3．2 异槲皮苷对体重的影响

3．3 异槲皮苷对糖脂代谢的影响

3．4 异槲皮苷对SOD与MDA的影响

3．5 异槲皮苷对血清胰岛素及胰高血糖素肽-1的影响

3．6 胰岛素指数计算

4．讨论

4．1 一般情况的变化

4．2 血糖的变化

4．3 血脂的变化

4．4 SOD与MDA的变化

4．5 胰岛素与胰高血糖素样肽-1的变化

4．6 胰岛素指数的变化

5．小结

第七章 异槲皮苷对STZ诱导糖尿病大鼠胰岛细胞的影响

1．实验材料与仪器

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

2．实验方法

2．1 切片的制作

2．2 胰腺的HE染色

2．3 醛复红染色

3．结果

3．1 胰脏HE染色与醛复红染色

4．讨论

5．小结

第八章 异槲皮苷对STZ诱导糖尿病大鼠肝脏形态、血液指标及肝细胞凋亡及周期的影响

1．材料

2．方法

2．1 肝脏组织切片制作

2．2 血液指标的测定

2．3 肝脏组织细胞凋亡与周期的检测

3．实验结果

3．1 肝脏组织切片观察

3．2 血液肝脏指标测定

3．3 肝脏组织细胞凋亡与周期观察

4 讨论

4．1 肝细胞HE染色

4．2 肝脏血液指标检测

4．3 肝脏组织细胞周期与凋亡率

5．小结

第九章 异槲皮苷对2型糖尿病大鼠DPP4、InsR、PI3K、AKT、PKA、PKCαmRNA表达水平的影响

1．实验材料与仪器

1．1 实验材料

1．2 实验仪器

2．实验方法

2．1 荧光定量PCR(qRT-PCR)引物设计与合成

2．2 组织材料中总RNA的提取

2．3 RNA沉淀的清洗

2．4 RNA的溶解

2．5 RNA纯度及浓度检测

2．6 RNA反转录(RT-PCR)

2．7 退火温度的优化与标准曲线的建立

2．8 DPP-4、InsR、PI3K、AKT、PKA、PKCα基因表达量的检测

3．实验结果

3．1 RNA纯度和浓度检测

3．2 引物特异性检测

3．2 退火温度的优化

3．3 标准曲线及扩增效率

3．4 各组基因相对表达量

4．讨论

4．1 荧光定量PCR

4．2 二肽基肽酶-4(DPP-4)

4．3 胰岛素受体(InsR)

4．4 磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)／蛋白激酶B(Akt)信号通路、蛋白激酶Cα亚型(PKCα)与蛋白激酶A(PKA)

5．小结

结论与创新

1．结论

2．创新性

致谢

参考文献