辣木叶黄酮的提取、分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究

摘要

辣木为辣木科辣木属热带多年生落叶乔木，原产于印度西北部的喜马拉雅山南麓，不仅可食用而且具有巨大的药用价值，被称为“神奇之树”。近年来，辣木在我国广东、广西、云南等西南省份得到广泛种植。辣木叶于2012年被我国卫生部门公布为新资源食品，黄酮类化合物是其重要的功能性成分之一。辣木叶黄酮（flavonoids fromMoringa oleifera Lam.leaves，FML）具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗癌等多种生理活性，可以开发成保健食品、临床药物、天然防腐剂等，应用前景广阔。本论文以FML为研究对象，优化了其提取、分离纯化工艺，初步分析了其结构，并对其抗氧化、抑菌、抑制胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的生物活性进行了研究。
　　本论文主要研究内容及结论如下:
　　1.利用响应面分析法对微波辅助提取FML的工艺进行优化。以乙醇浓度、料液比、提取时间和提取功率为影响因素，以黄酮提取率为响应值，在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken原理设计了一组4因素3水平实验。对29组实验数据进行拟合及统计学分析，得出最佳的提取条件为:提取时间308 s，提取功率302 W，乙醇浓度75％，料液比1∶52 g/mL，在此优化条件下，黄酮的提取率为5.53％，和模型预测值5.69％十分接近。
　　2.采用大孔树脂色谱柱和聚酰胺色谱柱联用的工艺对FML进行分离纯化。从6种极性不同的大孔树脂中筛选出AB-8型适合用于FML的分离纯化，并研究了其静态吸附动力及热力学特征。对色谱柱的分离纯化工艺进行了优化，得到AB-8型大孔色谱柱的最优条件为:上样浓度为7 mg/mL，上样流速为2 BV/h，上样体积为1 BV，洗脱液为70％乙醇溶液，洗脱液流速为2 BV/h，洗脱液体积为2.5 BV;聚酰胺色谱柱的最优条件为:上样浓度为4 mg/mL，上样流速为1.5BV/h，上样体积为1 BV，洗脱液浓度为70％，洗脱液流速为1.5 BV/h，洗脱液体积为3 BV。纯化后FML浸膏中黄酮的含量由13.38％提高到76.45％，并用HPLC测定了纯化前后FML中芦丁的含量，验证了分离纯化的效果。
　　3.用UPLC-Q-Orbitrap MS液质联用技术对纯化后的FML结构进行定性分析和鉴定。根据色谱和质谱信息，参考相关文献，分析鉴定出11个黄酮类化合物和2个酚酸类化合物，分别为:蔷薇苷、芦丁、牡荆素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-（6-丙二酰基葡萄糖苷）、槲皮素-3-O-羟甲基戊二酰基半乳糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷、槲皮素-3-O-乙酰基葡萄糖苷、山奈酚-3-O-丙二酰基己糖苷、山奈酚-3-O-羟甲基戊二酰基己糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷，3-咖啡酰奎宁酸和4-咖啡酰奎宁酸。
　　4.通过测定纯化前后的FML对DPPH自由、羟基自由的基清除能力及还原能力来评价其抗氧化能力，通过测定抑菌圈直径和最小抑菌浓度(MIC)来研究其抑菌活性。未纯化、纯化的FML对DPPH的半数清除浓度(EC50)分别为:0.03 mg/mL、0.438 mg/mL，对羟基自由基的EC50分别为:0.054 mg/mL、0.874 mg/mL，0.075 mg/mL纯化的FML与0.048 mg/mL VC具有相当的还原能力。未纯化的FML对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌有抑制作用，20 mg/mL时的最大抑菌圈直径分别为16.71、10.66、15.77 mm，MIC分别为10、5、10 mg/mL，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌无抑制。纯化后的FML对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌具有较好的抑制作用，20 mg/mL时最大抑菌圈直径分别为21.59、17.80、20.91、23.94 mm, MIC分别为1.250、2.500、0.625、1.250 mg/mL,对铜绿假单胞菌无抑制作用。纯化后FML的抗氧能力和抑菌活性好于纯化前。
　　5.用PNPP和PNPG法，分别测定FML对胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用，并通过Lineweaver-Burk双倒数作图法判断它们的抑制作用类型。结果表明纯化后的FML对胰脂肪酶具有较好的抑制作用，半数抑制浓度(IC50)为0.86 mg/mL，为非竞争性抑制;对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，IC50为4.18 mg/mL，为竞争性抑制。

目录

摘要

第1章 前言

1．1 辣木叶的研究概况

1．1．1 辣木简介

1．1．2 辣木叶中的营养成分

1．1．3 辣木叶中的黄酮类化合物

1．1．4 辣木叶中的绿原酸及其衍生物

1．1．5 辣木叶中的有机酸类化合物

1．1．6 辣木叶的生物活性

1．2 黄酮类化合物的结构与性质

1．2．1 黄酮类化合物的结构

1．2．2 黄酮类化合物的性质

1．3 黄酮类化合物的提取方法

1．3．1 溶剂提取法

1．3．2 微波辅助提取法

1．3．3 超声提取法

1．3．4 超临界流体萃取法

1．4 黄酮类化合物的分离纯化

1．4．1 大孔树脂色谱法

1．4．2 聚酰胺柱色谱法

1．4．3 高速逆流色谱法

1．5 黄酮类化合物的分析鉴定

1．5．1 薄层色谱法

1．5．2 高效液相色谱法

1．5．3 液相色谱-质谱联用分析法

1．6 植物来源的胰脂肪酶抑制剂研究概况

1．7 植物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂研究概况

1．8 本课题的研究意义与思路

1．8．1 研究意义

1．8．2 研究思路

第2章 微波辅助提取辣木叶黄酮工艺优化

2．1 实验材料和仪器

2．1．1 实验材料

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 辣木叶黄酮提取工艺流程

2．2．2 辣木叶黄酮含量的测定

2．2．3 单因素实验

2．2．4 响应面分析法优化辣木叶黄酮微波辅助提取工艺

2．3 结果与分析

2．3．1 芦丁溶液最大吸收波长的确定

2．3．2 芦丁标准曲线的绘制

2．3．3 单因素实验结果

2．3．4 响应面分析法优化实验结果及分析

2．4 本章小结

第3章 辣木叶黄酮的分离纯化

3．1 实验材料和仪器

3．1．1 实验材料

3．1．2 实验仪器

3．2 实验方法

3．2．1 树脂的预处理

3．2．2 辣木叶黄酮样品溶液的制备

3．2．3 大孔树脂静态吸附及解吸实验

3．2．4 AB-8型大孔树脂静态吸附动力学及热力学实验

3．2．5 AB-8型大孔树脂柱分离纯化辣木叶黄酮条件的优化

3．2．6 聚酰胺树脂柱分离纯化辣木叶黄酮条件的优化

3．2．7 纯化前后辣木叶黄酮含量的计算

3．2．8 HPLC分析纯化前后辣木叶黄酮中芦丁含量的变化

3．3 结果与分析

3．3．1 大孔树脂静态吸附及解吸实验结果及分析

3．3．2 AB-8型大孔树脂静态吸附动力学及热力学实验结果

3．3．3 AB-8型大孔树脂柱分离纯化辣木叶黄酮条件优化结果

3．3．4 聚酰胺树脂柱分离纯化辣木叶黄酮条件优化结果

3．3．5 纯化前后辣木叶黄酮含量的计算结果

3．3．6 HPLC分析纯化前后辣木叶黄酮中芦丁含量的变化

3．4 本章小结

第4章 辣木叶黄酮结构的初步分析

4．1 实验材料和仪器

4．1．1 实验材料

4．1．2 实验仪器

4．2 实验方法

4．2．1 样品溶液的制备

4．2．2 仪器条件

4．2．3 数据处理

4．3 结果与分析

4．4 本章小结

第5章 辣木叶黄酮体外抗氧化及抑菌活性研究

5．1 实验材料和仪器

5．1．1 实验材料

5．1．2 实验仪器

5．2 实验方法

5．2．1 辣木叶黄酮体外抗氧化活性研究

5．2．2 辣木叶黄酮抑菌活性研究

5．3 结果与分析

5．3．1 辣木叶黄酮体外抗氧化活性研究

5．3．2 辣木叶黄酮抑菌活性研究实验

5．4 本章小结

第6章 辣木叶黄酮对胰脂肪酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用

6．1 实验材料和仪器

6．1．1 实验材料

6．1．2 实验仪器

6．2 实验方法

6．2．1 辣木叶黄酮对胰脂肪酶抑制作用研究

6．2．2 辣木叶黄酮对胰脂肪酶抑制作用类型的研究

6．2．3 辣木叶黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制作用研究

6．2．4 辣木叶黄酮对α-葡萄糖苷酶抑制作用类型的研究

6．3 结果与分析

6．3．1 辣木叶黄酮对胰脂肪酶的抑制实验结果

6．3．2 辣木叶黄酮对胰脂肪酶的抑制作用类型

6．3．3 辣木叶黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制实验结果

6．3．4 辣木叶黄酮对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型

6．4 本章小结

第7章 总结与展望

7．1 结论

7．2 创新点

7．3 展望

参考文献

附录

附录Ⅱ 硕士期间已发表及待发表论文

致谢

声明