利用基因编辑技术对水稻品质和育性相关性状的遗传改良研究

摘要

水稻是重要的粮食作物，世界上有半数人口以大米为主食，随着我国人口的不断增加，生活水平的不断提高，对稻米品质多样化要求更高，给广大育种工作者带来了巨大的挑战。传统育种周期长、过程繁琐，而基因编辑技术为水稻重要农艺性状，特别是品质性状的快速改良提供了可能，可用于水稻品种间的改良育种。在本实验中我们以控制水稻粒长基因（GS3）、香味基因(BADH2)、温敏雄性不育基因（TGMS5）和影响水稻籽粒γ-氨基丁酸基因（OsGABA-1）作为研究对象;以本实验室现育成的籼、粳稻亲本为转化受体，运用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别对上述4个基因进行敲除，以期人工定向的改造育种材料，缩短育种进程。
　　主要研究结果如下:
　　(1)GS3与BADH2基因编辑
　　GS3基因是控制水稻粒长的主效基因，对粒长具有负调控的作用。BADH2基因是调控水稻稻米香味基因。通过构建CRISPR/Cas9双敲载体转化籼型杂交稻恢复系蜀恢573、保持系广8B和粳稻材料粳稻保持系辽39B、常规稻川农粳1号的愈伤组织，获得不同背景下转基因阳性植株。在T2代对GS3与BADH2共敲除的阳性植株进行表型鉴定分析，获得了具有香味的籼稻恢复系蜀恢573和保持系广8B，且农艺性状与野生型无显著差异。粳稻保持系辽39B和常规粳稻川农粳1号的阳性突变体植株与野生型比较，粒长变的更短、有香味，其他农艺性状没有发生明显变化。
　　(2)富含γ-氨基丁酸功能稻的创建
　　OsGABA-1是编码水稻体内γ-氨基丁酸转氨酶的基因，它负调控水稻中γ-氨基丁酸(GABA)的含量。通过CRISPR/Cas9基因编辑，对水稻的两个粳稻品种川农粳1号和川农香粳的OsGABA-1基因进行敲除。获得不同敲除背景下纯合的阳性植株。突变体表型分析发现垩白度比野生型显著增加。对突变体成熟种子中各种氨基酸以及γ-氨基丁酸含量的测定发现，突变体中γ-氨基丁酸含量显著增加，而其他农艺性状并没有发生显著变化，可用于预防高血压功能稻的开发。
　　(3)温敏不育材料的创制
　　水稻两系不育系具有育性受核基因控制，不受恢保关系限制且配组相对自由、种子繁育程序较为简单、成本低等优点。本实验中对两个农艺性状优良的粳稻品种川农香粳和辽宁引粳进行温敏不育基因TGMS5的编辑，获得纯合阳性突变体植株。在T2代转基因株系通过分期播种种植在海南，使其遭遇不同的高、低温环境。发现在低温环境下表现可育，能够正常结实，在高温环境下突变体表现为雄性部分不育。这说明通过TGMS5功能突变可人工创建温敏不育系。充分扩大水稻两系不育的种质资源，更好地应用于两系育种研究中。

目录

声明

摘要

符号说明

第一章文献综述

1．1基因编辑技术的研究历程

1．1．1锌指核酸酶(ZFNs)技术及其应用

1．1．2转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术及其应用

1．1．3 CRISPR／Cas基因编辑技术与应用

1．2．4个调控水稻重要农艺性状基因的研究进展

1．2．1调控水稻粒长基因(GS3)的研究进展

1．2．2水稻香味基因BADH2的研究进展

1．2．3 OsGABA-1基因的研究进展

1．2．4温敏不育TGMS5基因的研究进展

1．3论文选题和研究意义

第二章实验材料和方法

2．1．3生物试剂

2．1．4抗生素

2．1．5培养基的制备

2．1．6γ-氨基丁酸含量的测定仪器及材料

2．2实验方法

2．2．1生物信息学查询与检索

2．2．2GS3与BADH2双敲CRISPR／Cas9载体的构建

2．2．3 OsGABA-1与TGMS5基因单敲载体的构建

2．2．4炼苗与移栽

2．2．5转基因植株的PCR检测

2．2．6对PCR检测的单株进行测序检测

2．2．8突变体水稻稻米γ-氨基丁酸(γ-GABA)含量的测定

第三章结果与分析

3．1双敲背景材料GS3与BADH2基因型的鉴定

3．2载体的构建

3．3 GS3与BADH2双敲转基因植株的鉴定

3．3．1 GS3与BADH2双敲转基因植株的阳性鉴定

3．3．2 GS3与BADH2双基因编辑植株的表型分析

3．4 OsGABA-1基因单敲除植株的鉴定

3．4．2 OsGABA-1基因敲除植株的表型分析

3．4．3突变体植株体内γ-氨基丁酸含量的测定

3．5 TGMS5基因单敲植株的鉴定

3．5．1 TGMS5阳性植株的结果统计

3．5．2 TGMS5突变体在高温条件下花药育性观察

第四章讨论与分析

4．1 GS3与BADH2双基因编辑的表型分析与应用前景

4．2富含γ-氨基丁酸品种的创建与发展前景

4．3 TGMS5基因敲除后的表型分析与发展前景

参考文献

致谢

作者简历