利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定向改良水稻两个品质性状

摘要

在我国水稻育种中，品质改良已成为了攻关的热点。在水稻品质性状中，糯性和香味是水稻的特殊品质，CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展和成熟为糯性和香味的改良提供了高效的技术手段。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，分别针对杂交水稻亲本材料209B和Y58S进行糯性和香味的改良，分别对负调控直链淀粉含量基因Wx和稻米香味基因Badh2进行定点基因编辑，获得新型的优良杂交水稻亲本材料。有关研究结果如下:
　　1、水稻材料209B中的Wx位点进行定点编辑，针对Wx基因选择合适的靶位点，参与构建sgRNA表达盒，并pYLCRISPR/Cas9载体连接;单靶点载体利用农杆菌介导转化水稻材料209B;对T0、T1代转化植株定点编辑位置进行PCR检测和测序分析，分别测定转化植株精米直链淀粉含量，筛选出无外源转化元件的纯合突变体。结果表明，T0代209B突变材料中Wx位点的突变频率高达66.7％，其中纯合缺失突变率表型为直链淀粉在4％以下占33.3％;
　　2、水稻材料Y58S中的Badh2位点进行定点编辑，针对Badh2基因选择合适的靶位点，参与构建sgRNA表达盒与pYLCRISPR/Cas9载体连接;双靶点载体利用农杆菌介导转化水稻材料Y58S;对T0、T1代转化植株定点编辑位置进行PCR检测和测序分析，分别鉴定转化植株是否含有香味物质，再对T0、T1代突变植株进行遗传分析，T0代纯合突变植株能稳定地遗传给T1代植株中，T0代双等位突变植株在遗传过程中符合孟德尔遗传定律，并且在突变植株遗传分离过程中可以用琼脂糖凝胶电泳检测获得没有外源基因元件的T-DNA-free突变体植株。结果表明，T0代Y58S突变材料中Badh2位点的突变频率高达69.7％，其中纯合缺失突变率表型为转化植株有强烈香味的占31.3％;
　　3、对T1代T-DNA-free纯合突变体的调查分析结果表明:多数Wx基因突变体能显著降低直链淀粉含量，所获得的209B水稻T1代纯合突变体材料直链淀粉含量仅1％，糯性品质优良，其他主要农艺性状、经济性状与对照材料无显著差异，所转育的材料具有重要的现实意义;所获得的Y58S水稻T1代纯合突变体有强烈的香味物质，品质优良，其中如株高、穗数、剑叶长、剑叶宽、穗长、每穗粒数和结实率这些主要农艺性状与对照材料没发生显著改变，所转育的材料具有重要的实践意义。

目录

声明

摘要

前言

1．1 基因组编辑技术发展历程

1．1．1 锌指蛋白核酸酶技术(ZFNs)

1．1．2 转录激活因子效应物核酸酶技术(TALENs)

1．2 CRISPR／Cas9系统

1．2．1 CRISPR／Cas系统发展

1．2．2 CRISPR／Cas系统的分类

1．2．3 CRISPR／Cas9系统的作用原理

1．2．4 CRISPR／Cas9靶位点设计原则

1．2．5 CRISPR／Cas9系统的应用

1．2．6 CRISPR／Cas9系统在植物研究中的应用

1．2．7 CRISPR／Cas9系统潜在问题

1．3 水稻品质性状简介

1．3．1 水稻糯性性状

1．3．2 水稻香味性状

1．4 研究目的与意义

2．1 研究材料

2．1．4 主要试剂与培养基

2．2 研究方法

2．2．1 相关生物学实验方法

2．2．2 CRISPR／Cas9多靶点载体的构建

2．2．3 连接产物的转化(电击法)

2．2．4 阳性克隆检测

2．2．5 农杆菌介导的遗传转化

2．2．6 水稻材料T0代阳性植株检测

2．2．9 双波长法测定水稻转化植株中直链淀粉含量

2．2．10 氢氧化钾浸泡法鉴定水稻转化植株香味

2．2．11 转化植株主要农艺性状分析

3 研究结果

3．1 水稻材料中两个品质性状基因靶位点检测

3．2 CRISPR／Cas9多靶点载体的构建

3．2．1 水稻两个品质性状基因的靶点引物

3．2．2 不同载体的sgRNA表达盒构建

3．2．3 Cas9／sgRNA表达载体的构建

3．3 水稻材料遗传转化

3．4 水稻材料T0代阳性植株检测

3．5 水稻材料T0代植株突变情况分析

3．6 T-DNA-free检测

3．7 水稻材料209B的T0代及T1代突变植株直链淀粉的含量分析

3．8 水稻材料Y58S的T0代及T1代突变植株香味分析

3．9 水稻材料209B和Y58S的T0代纯合突变植株主要农艺性状考察

3．10 水稻材料209B和Y58S的T1代纯合突变植株主要农艺性状考察

4．1 讨论

4．1．1 CRISPR／Cas9系统中脱靶效应的影响因素

4．1．2 CRISPR／Cas9系统中稳定性遗传特点

4．2 结论

4．3 创新点

4．4 问题与展望

参考文献

致谢

附录

攻读学位期间发表论文情况