利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定向改良水稻稻瘟病抗性

摘要

水稻作为世界上食用人口最多的农作物，其产量每年都会因稻瘟病的流行而减产。目前，控制稻瘟病爆发的有效策略就是使用抗性品种。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术的诞生解决了传统育种过程中育种年限及连锁累赘等问题，为作物遗传改良提供了新的育种平台。本研究利用CRISPR/Cas9系统对水稻Pita，Pi21和ERF922稻瘟病相关基因进行定点编辑，以期获得能够稳定遗传的抗抗稻瘟病水稻材料。本研究主要结果如下: 1.Pi21基因是在隐性状态下发挥对稻瘟病菌的抗性，而ERF922则负调控稻瘟病菌的抗性，Pita对稻瘟病的抗感差异是由于第918位氨基酸位点的变化而引起。我们选择3个基因的第一外显子靠近ATG附近的序列作为靶序列构建共编辑载体pC1300-2×35S∷Cas9-gPita-gPi21-gERF922，用农杆菌转化长粒粳稻恢复系L1014。在T0代转基因阳性株中，Pita，Pi21和ERF922三个基因发生突变的频率分别为75％，85％和75％，Pita发生突变的基因型多为双等位突变(47.1％)，其次，纯合基因型的频率为41.2％，无杂合基因型的出现，但有2株阳性苗在Pita靶点处未发生突变(11.7％)，在基因突变类型中有73.5％是碱基的插入，14.7％为碱基的缺失，有11.8％的频率是碱基未发生改变;Pi21突变基因型的情况与Pita类似，双等位突变频率为58.8％，其次纯合基因型频率为35.3％，而杂合基因型频率为5.9％，但基因突变类型以碱基缺失为主，频率高达85.3‰另外，有8.8％、2.9％和2.9％分别为碱基插入、替换和无突变的类型;ERF922的突变类型较为丰富，包括碱基的插入、缺失、替换及替换缺失同时发生这四种类型，其中碱基缺失频率最大(50％)。通过农杆菌将Pita、Pi21和ERF922三基因共转化长粒粳稻恢复系L1014，随着Pi21和ERF922的突变Pita往往也发生突变，三基因的诱导事件趋向于同时发生突变，因此，该转化实验中只出现Pi21的单突基因型和Pita、Pi21和ERF922的三突基因型。通过对T1代分离群体的筛选，得到了2种Pi21单基因突变和1种Pita Pi21和ERF922三基因突变不含T-DNA成分的纯合突变株系，并以此分别构建3个T2代纯合突变系群体(D2101、D2102和D0301)。 2.对三种纯合突变株系的苗期进行稻瘟菌接种鉴定，并在接种后0h、12h、24h分别取样。结果表明，纯合突变株系的抗性相比于野生有显著的提高。对接种后的纯合株系和野生型的防卫相关基因的表达量进行分析，相较于野生型，突变株系增强了水杨酸，茉莉酸和乙烯的信号转导途径相关基因的表达，因此，我们推测这些防御相关基因的高表达增强了突变株系对稻瘟病的抗性。同时对纯合突变株系的主要农艺性状进行考察，其株高、剑叶长、剑叶宽、穗长、有效穗数、每穗粒数、结实率及千粒重与野生型无明显的差异。 利用CRISPR/Cas9技术获得了能够稳定遗传和具有一定稻瘟病抗性的纯合突变株系，为水稻稻瘟病抗性改良提供了良好的材料。