利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建水稻ospin9突变体

摘要

[目的]生长素输出载体蛋白(PIN-FORMED,PIN)是控制生长素极性运输的关键蛋白,水稻OsPIN9是单子叶植物特有的PIN基因,但其生物学功能仍有待研究.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对OsPIN9进行编辑,获得OsPIN9发生突变的基因编辑株系,对进一步深入研究OsPIN9功能提供依据.[方法]根据OsPIN9序列设计特异性编辑位点,构建OsPIN9编辑载体,以日本晴愈伤组织为受体,通过农杆菌介导法获得抗性植株,通过PCR鉴定转基因植株.转基因植株通过PCR和测序明确OsPIN9的突变类型,获得ospin9纯合突变体并分析突变蛋白与野生型蛋白的差异.qRT-PCR分析突变体幼苗根部OsPINs的表达,进一步明确突变体与野生型对照植株之间的表型差异.以0.05μmol·L-1的萘乙酸(1-naphthaleneacetic acid,NAA)处理幼苗7 d,分析NAA对植株表型的影响.[结果]在水稻OsPIN9第1外显子处设计靶点并构建表达载体,通过遗传转化成功获得18株T0代转基因植株,测序分析发现转基因株系中有3种不同的突变方式,均为在靶位点的18位碱基处插入不同的单碱基,其中,3株插入T碱基,3株插入G碱基,1株插入C碱基,共获得基因编辑株系7株,进一步鉴定获得2种纯合突变体.序列比对分析表明,这两种类型的突变均造成移码突变和蛋白翻译提前终止,由原来的426个氨基酸缩短为172个氨基酸,跨膜螺旋结构域分析表明突变体中OsPIN9蛋白的跨膜结构完全消失.qRT-PCR分析表明,2个突变株系的OsPIN9转录水平显著降低,OsPIN1a和OsPIN5b表达上调,而OsPIN5a表达受到抑制.幼苗期的表型分析表明,突变体的株高显著低于野生型,不定根数显著少于野生型,但根长没有显著变化.NAA处理下,植株的生长受到抑制,ospin9突变体的不定根数仍少于野生型,但差异已不显著.[结论]利用CRISPR/Cas9技术对水稻生长素输出载体蛋白OsPIN9进行定向编辑,可获得无转基因成分的基因编辑植株,OsPIN9的突变影响其他OsPINs的表达,ospin9突变体的地上部和地下部的发育都受到抑制,NAA处理能部分恢复突变体不定根的发育.