多色引物原位标记技术快速检测人类精子染色体数目异常

摘要

目的：染色体数目异常是人类染色体疾病的重要类型，经常导致胚胎丢失、胎儿流产、婴儿死亡、先天畸形和神经发育异常等出生缺陷。引物原位标记技术同时结合了FISH和PCR技术的优势，已经成为替代FISH的一项技术用于染色体数目异常的检测。自引物原位标记技术广泛引入人类基因组研究和临床染色体检查以来，特异染色体引物的设计和评估主要基于特定染色体alpha卫星重复序列单元的克隆信息。至2001年，人类基因图谱的绘制完成，人们可以方便的在互联网上任意调取人类的全基因组序列，并通过新的计算机一互联网工具，快速准确地分析DNA序列和比对整个基因组序列，设计和验证引物。今天人们可以用更新更完整的基因组信息和技术回顾传统的引物序列，对其有效性和可靠性进行重新的评估。本文试图用新的基因组工具检验和完善非ddNTP阻断的多色引物原位标记技术，探索一种更为合理的多色PRINS系统程序，并针对精子染色体异倍性的研究进行可靠性分析。 方法：首先我们将传统引物都与最新的人类基因组信息进行了比对。BLAST比对结果在大多数情况下验证了这些经典引物的退火有效性。随后在人类外周血淋巴细胞中建立了一个稳定的多色PRINS标记方法并评估其标记效率。通过双色PRINS预实验，分析不同的靶标序列和荧光色素的标记特点以确定PRINS标记顺序；随后，采用非ddNTP阻断的三色PRINS方法，对外周血中期淋巴细胞的18号，21号，X和Y染色体构建了更为稳定的多色标记体系。同时，一个克氏综合征(47，XXY)的特殊外周血样本用来证明信号与染色体的数目匹配性，评估多色PRINS方法应用于染色体数目异常快速诊断的可行性。根据相关文献，PRINS技术应该比FISH更适于精子核的标记。本文精子实验中，在PRINS反应之前，我们采用3M NaOH溶液进行4-5分钟的预处理，以达到对精子核同时去浓缩和变性的目的。在单色精子PRINS预实验和双色淋巴细胞PRINS预实验的指导下，引物的使用条件(包括浓度和温度等)以及靶标--dUTP--荧光色素的标记组合使用顺序得到了优化，最终在外周血淋巴细胞获得了均一的多色荧光标记信号，反应时间限制在3.5个小时内。我们对2份正常男性精液标本的4条染色体(含18号，21号两条常染色体和X，Y两条性染色体)进行了分析。 结果：成功地在2.5小时内标记了同一精子核内的多条染色体，最佳的染色体同时标记通量为3条，单色以上标记率达到99％。对每条染色体的评估都至少分析5000个精子核(性染色体则更多)。精子染色体中常染色体的平均二体率为18号染色体的O.125％到21号染色体的0.152％，性染色体的平均二体率为XX二体的0.085％到XY二染色体的0.102％。与外周血淋巴细胞二色PRINS的检测结果类似，21号染色体的二体率比其他染色体略高。尽管从结果来看常染色体的二体率比性染色体稍高，但没有显著的统计学意义。二倍体率则由0.035％到0.083％浮动，也没有统计得到显著的异质性(P<0.05)。同时在实验中观察到二体率比二倍率要高的情况，这可能意味着在精子形成的减数分裂过程中，二体更易(或有更多的机会)形成。 结论：引物原位标记技术看起来是检测人类外周血淋巴细胞中期染色体和精子染色体数目异常的一项经济简便和快速可靠的高通量检测方法。我们建议在引用某些经典引物之前，与人类全基因组的BLAST比对能够推断其反应的有效性，有着很强的指导意义和必要性。同时也需要引物标记预实验来考察匹配不清的引物效果，甚或重新设计引物。PRINS应用于染色体检测，预实验和严格的反应条件控制是不可缺少的。

目录

声明

摘要

前言

第一部分培养的人类外周血淋巴细胞单色PRINS标记及与FISH的比较

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与讨论

2.1结果

2.2讨论

第二部分培养的人类外周血淋巴细胞双色PRINS标记

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与讨论

2.1结果

2.2讨论

第三部分克氏综合征患者外周血淋巴细胞培养后的三色PRINS标记

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与讨论

2.1结果

2.2讨论

第四部分正常男性精子的PRINS标记与异倍体分析

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与讨论

2.1结果

2.2讨论

小结

参考文献

综述引物原位标记技术趋势与进展

1 PRINS技术简介

2 PRINS技术的优势与不足

2.1特点与优势

2.2不足与弥补

2.3 FISH与PRINS，竞争者还是互补者

3 PRINS技术的应用

3.1染色体病的检测

3.2基因的诊断

3.3肿瘤病因分析

3.4端粒等重复序列的标记

3.5基因组比较与进化分析

4衍生技术与发展趋势

4.1更快的标记速度

4.2更高的标记通量

4.3更强的标记信号

4.4更小的标记单元

5展望

参考文献

在校期间参加的科研工作与成果

致谢