新型超分子层层自组装微囊肝细胞培养体系构建的研究

摘要

急性肝功能衰竭(Acute Liver Failure，ALF)，是一种严重的临床综合征，其致死率高达60％～90%。肝移植已经被认为是爆发性肝炎、终末期肝病的有效治疗手段，然而，供肝短缺、高发病率、高死亡率、昂贵治疗费用高昂以及术后终生应用免疫抑制剂等一系列问题困扰着肝移植广泛开展。特别是供肝的短缺极大的限制了可能行肝移植的数量，许多病人在等待移植中死去，多年来，人们一直在致力于发展肝脏支持系统维持肝功能，肝脏支持系统作为一个过渡措施架起了通往移植的桥梁，但是肝脏支持系统仍然没有发展成熟，许多方面依然没有达到临床治疗的标准，本研究的目的就是设计制备一种新型的超分子层层自组装微囊，并且在体外用此微囊去微囊化包裹肝细胞，评估肝细胞在其中的生长，增殖情况和细胞的生物学活性，作为迈向生物人工肝的基础研究。
　　 在这项研究中，微囊由低分子肝素钠(low-molecular-weight heparin sodium，LMWH)、海藻酸钠(algin，ALG)和壳聚糖(chitosan,CS)利用超分子层层自组装技术通过高压脉冲微囊成形仪制备而成，微囊的大小通过仔细的调整高压脉冲微囊成形仪的电压、频率和脉宽来控制和优化，优化后的微囊进一步去研究其物理性质，诸如，微囊壁的分子截留孔径、微囊的表面形态、微囊壁的厚度、微囊表面的电荷、机械强度、生物相容性和免疫隔离作用等。随后，通过改良门静脉灌注胶原酶消化法分离小鼠原代肝细胞，经适当培养后在其活力良好时通过新型微囊进行微囊化包裹，同时利用ACA微囊成型技术微囊化包裹肝细胞，把这两种微囊化肝细胞与原代单层平面培养肝细胞进行分组进行生物学实验，组1为ALG-CS-ALG(ACA)微囊化肝细胞组；组2为ALG+LMWH-CS-ALG+LMWH(ALCAL)微囊化肝细胞组；组3为单层肝细胞平面培养组(Tissue culture polystyrene，TCPS);对兰组细胞进行17天的培养，在培养后1天、2天、3天、5天，取样观察细胞活率、增殖状态，部分取样进行HE染色制作切片观察各个时间细胞的形态变化和凋亡及坏死情况，并在培养后每隔一天总9个时间点取培养液样本分析其中糖、白蛋白、谷草转氨酶的浓度变化以评价微囊化细胞的功能变化。
　　 本项研究的结果显示新型层层自组装微囊ALCAL大小理想，直径600-800um，平均直径782.8um，ALCAL微囊外表光滑，囊壁具有合适的分子截留孔径、囊壁的厚度大约在2-3nm左右，表面分布阴性电荷，ALCAL微囊具有较强的机械强度，较好的长期稳定性和短期稳定性，拥有良好的生物相容性，ALCAL微囊的溶涨率是10.7%，溶缩率是33.1%。对其进行的通透性实验发现其具有明显的免疫隔离作用，其囊壁能让FITC-BSA通过，但能阻挡FITC-IgG等大分子物质进入囊内，ALCAL微囊化包裹的肝细胞培养后保持了其细胞活力，与原代单层平面细胞培养相比显示了更好的代谢活性，组1和组2在细胞活率和代谢功能上没有明显的差异，微囊化细胞具有强烈的分泌蛋白功能，保持了细胞活力。
　　 本研究制备的新型微囊ALCAL具有良好的生物相容性，明显的免疫隔离作用和稳定的符合实验要求的物理性质，微囊化肝细胞生存率高、活性好，在行ALCAL微囊化包裹后在微囊肝细胞系统中保持了细胞的功能。