人工肝细胞微流体微囊制备方法及其微流体微囊发生装置

摘要

本发明涉及组织工程和实验室设备技术领域，特别涉及一种人工肝细胞微流体微囊制备方法及其该方法的专用设备—一种微流体微囊发生装置。本发明利用海藻酸钠与氯化钙反应生成海藻酸钙水凝胶的化学原理，通过设计微流体装置，借助连续相液体对分散相液体的剪切力、表面张力等作用形成大小稳定的微囊。本发明制备得到的人工肝细胞微囊，能较长时间的维持囊内种子细胞功能，在体外肝衰竭类似血浆影响下和体内炎症因素作用下依然能代谢有害物质，保持一定的肝功能，有望应用于生物人工肝系统和细胞治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及组织工程和实验室设备技术领域，特别涉及一种人工肝细胞微流体微囊制备方法及其―种微流体微囊发生装置。

背景技术

肝衰竭是常见的危重疾病，病情复杂，死亡率高。肝移植是治疗肝衰竭较为有效的方法，但临床上供体肝来源严重缺乏，很多患者在等待移植的过程中死亡。因此急需发明一种切实有效的生物人工肝支持系统，来暂代肝脏功能，给患者自身肝脏恢复创造一个良好的环境，或帮助患者顺利过渡到移植手术期。生物人工肝支持系统中最核心的部分是种子细胞，该细胞能代替肝脏行使代谢、解毒、合成等功能，最理想的就是原代自体肝细胞，然而到肝病终末期，患者自体肝细胞状态往往很差，难以胜任此工作。国内外研究较多的种子细胞有原代猪肝细胞、功能改进后的人肝癌细胞株、IPS类肝细胞和原代异体肝细胞等。常用的二维细胞培养模式很难维持这些细胞的功能。

微囊化细胞培养技术是利用生物兼容性高分子材料形成微囊将细胞包裹在其中实现三维培养的一种技术，形成的微囊可以阻绝免疫细胞及大分子抗体进入囊内，同时允许氧气、营养物质和一些具有生物活性的小分子物质自由出入，能较好的保护囊内细胞维持细胞活性及功能。有学者将微囊化原代猪肝细胞应用于生物人工肝研究，取得了一定的成效。然而，常用的依靠高速气流(SugiuraS，OdaT，AoyagiY，eta1..Microfabricatedairflownozzleformicroencapsulationoflivingcellsinto150micrometermicrocapsules[J].BiomedMicrodevices，2007，9：91—99)、高压静电(WillaertRG,BaronGV.Gelentrapmentandmicro—encapsulation：methods,applicationsandengineeringprinciples[J].RevChemEng.,1996,12:185-205)等微囊发生装置难以得到大小稳定的微囊，且制作成本高，制作过程容易对细胞造成损伤。

微流体技术是指采用微细加工技术制作出微通道网络结构，或者将各种微细管道把实验室大型设备集成在尽可能小的操作平台上，用以完成不同实验的技术。近些年来，该技术在化学、生物学等领域得到广泛应用，它不仅使试剂的消耗降低，而且使实验速度提高，费用降低，充分体现了当今实验室设备微型化、集成化和便携化的发展趋势(林炳承,秦建华.微流控芯片分析化学实验室[J].高等学校化学学报,2009,03:433-445)。因此，开发基于微流体的微囊发生装置将简化实验步骤，缩小实验设备，精确控制微囊大小，减小微囊制作过程对细胞造成伤害。

海藻酸钠凝胶因具有生物相容性好、细胞毒性较低、无免疫原性、可被生物降解、可以在适宜的条件下加工成形等优点，正被广泛应用于制作生物医学领域的微囊，例如甲状腺细胞、胰岛细胞、肝细胞的包囊(PrakashS.Artificialcelltherapy：Newstrategiesforthetherapeuticdeliveryoflivebacteria[J].JournalofBiomedicineandBiotechnology,2005，44—56)。单纯的海藻酸钠微囊化肝细胞，较传统的二维细胞培养模式能更好的维持肝细胞功能。但由于肝细胞生长的特殊性，例如贴壁生长、需要胶原支撑等，单纯的海藻酸钠微囊尚无法长时间维持其功能，离应用于生物人工肝系统还有一段距离。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工肝细胞微流体微囊制备方法，本发明的另一目的在于提供一种人工肝细胞用微流体微囊发生装置。

本发明的主要技术方案包括，利用海藻酸钠与氯化钙反应生成海藻酸钙水凝胶的化学原理，通过设计微流体装置，借助连续相液体(如豆油)对分散相液体(如海藻酸钠与氯化钙)的剪切力、表面张力等作用形成大小稳定的微囊，并且在海藻酸钠凝胶中加入了胶原和磁性物质，让其更适合种子细胞三维生长和应用于生物人工肝支持系统。

为实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：

本发明的第一方面，提供了一种微流体微囊发生装置，包括上样推进组件、成囊组件、分离成膜组件；

所述的上样推进组件，包括微量推注泵和三个注射器；

所述的成囊组件，为连续的微流体通道；前端为微流体通道接入端，内置一个连续相通道和两个分散相通道；后端为中空的波形微流体通道；

所述的分离成膜组件，依次包括油水分离器和旋转成膜台；所述的旋转成膜台由转台和至少六个收集管组成。

所述的微流体通道，包括采用硅、或玻璃、或聚甲基丙烯酸甲酯、或聚二甲基硅氧烷微流体芯片经微加工技术建立微流体通道网络或选择各种针头、聚合物管、中空纤维等粘合而成。

所述的一个连续相通道和两个分散相通道分别与三个注射器相连；

所述的波形微流体通道最后伸入油水分离器中；

本发明的一种微流体微囊发生装置，还包括移液管，用于将油水分离器中分离得到的微囊移至旋转成膜台。

本发明的一种微流体微囊发生装置，还包括网兜，用于盛接移液管移来的微囊，并放置于旋转成膜台的收集管中。

本发明的一种微流体微囊发生装置，所述的油水分离器底部设置一个磁场发生装置。

本发明的第二方面，提供了一种人工肝细胞微流体微囊制备方法，所述的方法包括以下步骤：

A、海藻酸钠混合溶液的制备：

本步骤中的海藻酸钠混合溶液，为海藻酸钠混悬溶液未加种子细胞的溶液(即海藻酸钠混合溶液加种子细胞后称为海藻酸钠混悬溶液)。

用生理盐水溶解海藻酸钠配制1.5％-2.0％(质量浓度)的海藻酸钠溶液，混入磁性物质，使磁性物质在海藻酸钠溶液中的比例为1-5mg/mL(重量体积比，W/V，优选2mg/mL)，将此混合物用钴60照射除菌；

再以1：15-30(优选1：26)的体积比加入Matrigel基质胶，混合均匀，4℃冰箱保藏备用；

B、微囊的制备

分散相一，为种子细胞充分混匀于步骤A得到的海藻酸钠混合溶液中得到分散相一(AS)；

分散相二，氯化钙(IS)，除菌；

连续相，为不溶于水的油性介质(OI)，如大豆油、甲基硅油等，除菌；

将AS、IS、OI分别装入注射器中，用微量推注泵推注入微流体通道中；

在微流体通道中形成微囊后进入油水分离器，待微囊表面形成一层钙化的外膜后，进行油水分离，并用生理盐水洗涤；

移至旋转成膜台，优选的用网兜兜住微囊后，依次通过0.1％多聚赖氨酸溶液——生理盐水——0.15％海藻酸钠溶液——生理盐水——55mmol/L的柠檬酸钠溶液——生理盐水，得到最终的微囊——人工肝细胞微流体微囊。

上述的人工肝细胞微流体微囊制备方法，还包括步骤C、将步骤B获得的微囊置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育。

本发明所述的种子细胞为原代猪肝细胞、功能改进后的人肝癌细胞株、IPS类肝细胞和原代异体肝细胞等。

本发明步骤B得到的最终的微囊，结构是海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-poly-lysine-alginate，APA)微囊。

本发明步骤B中的油水分离，在本发明的一个优选实施例中，在油水分离器底部添加一个大小0.5-1T(优选为0.6T)的磁场，更易于油水分离，并且在外加磁场条件下，可进一步缩短混合微囊的沉降时间，表现出良好的磁响应性。

本发明步骤B得到的最终的微囊，粒径以50—500μm为优，直径500μm左右的微囊可应用于生物人工肝支持系统，直径50μm左右的微囊可应用于细胞治疗。

本发明步骤B中所得微囊在油水分离器中放置10min左右，可在微囊表面形成一层钙化的外膜。

所述的步骤A中，本发明对微囊成分进行了改进，包括加入胶原与磁性物质。所述胶原为对维持肝细胞功能有益的胶原，如Matrigel基质胶。所述磁性物质为粒径在10nm～100μm的铁磁性物质或顺磁性物质，如铁、镍、四氧化三铁等。

所述的步骤B中，分散相包括海藻酸钠溶液和二价离子溶液；所述海藻酸钠溶液为未修饰海藻酸钠、精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)修饰海藻酸钠、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)修饰海藻酸钠、酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)修饰海藻酸钠中一种或二种以上的海藻酸钠。所述二价离子溶液为能与海藻酸钠固化成囊的二价离子溶液，如氯化钙溶液。

所述的步骤B中，本发明的微流体通道，可通过微流体芯片经微加工技术建立微流体通道网络或选择各种针头、聚合物管、中空纤维等粘合而成。包括一个连续相入口，注入油相液体(简称OI)；两个分散相入口，一个注入二价离子溶液(简称IS)，一个注入种子细胞与海藻酸钠的混悬溶液(简称AS)；一个出口，将形成的微囊排出。IS与AS需以相同流速，同时达到通道内。OI流速比分散相的要快，从而可以在IS与AS相遇接触的瞬间将其固化物夹断，形成微囊。可以通过控制OI流速与分散相流速和调整通道直径来精密控制微囊的大小。较优的，分散相以100ul/min的速度推注，连续相以55ml/h的速度推注。

本发明中凡与微囊直接接触的溶液与设备均需无菌，微囊制备操作最好在低温环境中进行。

本发明的第三方面，提供了上述的人工肝细胞微流体微囊制备方法、上述的人工肝细胞微流体微囊发生装置在制备人工肝(肝移植物)中的应用。

所述的应用，具体是将上述方法和装置制备得到的人工肝细胞微囊，经培养后，应用于生物人工肝系统或者细胞治疗。

本发明的有益效果是：

1)本发明基于微流体技术利用海藻酸钠制备微囊，设备精简，取材方便，操作简单。避免了以往高速气流、高压静电对种子细胞造成损伤。整个装置可集成于一个较小的平台中，便于全程无菌操作。

2)本发明的微流体微囊发生装置可精确调控微囊大小，且稳定性高。不同大小的微囊可进行相应研究，如直径500μm左右的微囊可应用于生物人工肝支持系统，直径50μm左右的微囊可应用于细胞治疗。

3)本发明在海藻酸钠混合溶液中加入Matrigel基质胶，在给细胞形成生物保护膜、隔绝免疫攻击的同时为细胞生长提供了良好的生存微环境，有利于细胞实现体外三维培养，维持功能。

4)本发明在海藻酸钠混合溶液中加入磁性物质，有较高的磁响应性。如在微囊发生过程中可通过外加磁场，便于油水分离和收获。在应用于生物人工肝灌流式反应器中，可通过外加磁场增大单位体积内微囊密度，还可对微囊进行抗重力悬浮培养。在应用于细胞治疗时，可以通过外部磁场将微囊定位至病变部位，还可结合现代磁共振技术，在体追踪微囊情况。

5)本发明制备得到的人工肝细胞微囊，能较长时间的维持囊内种子细胞功能，在体外肝衰竭类似血浆影响下和体内炎症因素作用下依然能代谢有害物质，保持一定的肝功能，有望应用于生物人工肝系统和细胞治疗。

附图说明

图1是一种微流体微囊发生装置的整体结构示意图；

图2是图1所示装置中成囊组件微流体通道透视图，右上角虚线框内为局部俯视放大图；

图3是本发明装置发生的微囊化肝癌细胞HepG2光镜图，A为培养第7天100x光镜图，B为培养第7天200x光镜局部放大图片，白色箭头所示为三维化生长的HepG2细胞球；

图4是微囊成分改良前后微囊机械强度实验结果图；

图5是在微囊制备过程中磁响应性实验结果图；

图6是微囊化原代肝细胞在肝衰竭类似血浆中耐受实验结果图，其中A为ALT检测结果，B为AST检测结果，C为UREA检测结果，D为TBIL检测结果(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

其中：

1-上样推进组件11-微量推注泵12-注射器

13-注射器14-注射器

2-成囊组件21-微流体通道接入端22-波形微流体通道

3-油水分离器31-隔板32-移液管

4-旋转成膜台41-网兜42-转台

A-收集管B-收集管C-收集管

D-收集管E-收集管F-收集管

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例，对本发明做进一步说明。

实施例1：本发明的一种微流体微囊发生装置

一种微流体微囊发生装置，如图1、图2所示，包括上样推进组件1、成囊组件2、分离成膜组件3；

所述的上样推进组件，包括微量推注泵11和三个注射器12、13、14；

所述的成囊组件，为连续的微流体通道；前端为微流体通道接入端21，内置一个连续相通道和两个分散相通道；后端为中空的波形微流体通道22；

所述的分离成膜组件，依次包括油水分离器3和旋转成膜台4；所述的旋转成膜台由转台42和至少六个收集管组成。

所述的一个连续相通道与注射器14相连；

所述的两个分散相通道分别与注射器12、13相连；

所述的波形微流体通道22最后伸入油水分离器3中。

实施例2：微囊化肝癌细胞HepG2的制备及培养

本实施例采用的细胞材料为肝癌细胞HepG2(HepG2细胞购自中科院细胞所)，消化离心后将HepG2细胞与1.8％海藻酸钠混合溶液充分混匀，终浓度为5x10⁶个/ml，将其装入图1所示10ml注射器13中。注射器12中加入与注射器13等体积的1.1％氯化钙溶液，注射器14注入大豆油。

微量推注泵11，可以控制所有注射器的上样推进速度，较优的，注射器12与13以100ul/min的速度推注(配一个共同的微量推注泵)，注射器14以55ml/h的速度推注(单独一个微量推注泵)。

分散相和连续相溶液在微流体通道接入端21中形成微囊，在波形微流体通道22中稳定微囊结构。

在油水分离器3中实现油水分离，用移液管32将微囊转移至41所示的网兜中，让网兜在42所示的转台中逆时针依次通过收集A0.1％多聚赖氨酸溶液5min——收集B生理盐水1min——收集C0.15％海藻酸钠溶液10min——收集管D生理盐水1min——收集E55mmol/L的柠檬酸钠溶液10min——收集F生理盐水1min。

将微囊化后的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中，DMEM完全培养基(购自GibcoBRL公司)常规培养，按时换液。7天后，用倒置显微镜观察形态。微囊化后细胞实现三维生长，增殖迅速。如图3所示，A为培养第7天微100x光镜图，B为培养第7天200x光镜局部放大图片，白色箭头所示为三维化生长的HepG2细胞球。

实施例3：微囊成分改良前后微囊机械强度检测

本实施例以微囊破损率(破损微囊数与微囊总数之比)为指标考察微囊的机械强度。

将HepG2细胞分别与1.8％海藻酸钠溶液(改良前组)、1.8％海藻酸钠混合溶液(改良后组)充分混匀，按照实施例2分别制成微囊。将微囊悬于DMEM完全培养基中，调整培养基中的微囊数量为100个/ml。分别取新鲜制备的上述悬液50ml置于100ml烧杯中，在磁力搅拌机上分别以低、中、高速搅拌1min，然后在显微镜下随机计数100个微囊中破损微囊个数，重复3遍。分别以低、中、高速组统计改良前组与改良后组的微囊破损率，统计检验选择Student-t检验，P<0.05为差异有统计学意义，结果显示无论在低速组、中速组、高速组中，改良前组与改良后组的结果均无明显统计学意义，见图4。表明改良前后微囊机械强度无明显改变。

实施例4：微囊制备过程中磁响应性实验

本实施例以在外加磁场条件下，油水分离器中微囊完全沉降时间为指标考察微囊磁响应性。

将HepG2细胞分别与1.8％海藻酸钠溶液(准备2管，标记为A、B)、1.8％海藻酸钠混合溶液(准备2管，标记为C、D)充分混匀，4管溶液分别按照实施例2步骤制备微囊到分离器时停止操作。A、C为一组，在油水分离器底部无外加磁场；B、D为一组，在油水分离器底部添加一大小相等，方向相同的磁场，大小为0.6T，观察记录两种情况下A、B、C、D微囊沉降速度，记录微囊完全沉降时间，重复3遍。统计各组沉降时间，统计检验选择单因素方差分析，组间比较选用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义，结果显示A与B之间无明显统计学意义，C较A沉降时间缩短(P<0.001)，D较C沉降时间缩短(P<0.01)，见图5。

实验结果表明1.8％海藻酸钠混合微囊较单纯的1.8％海藻酸钠更易于油水分离，在外加磁场条件下，可进一步缩短混合微囊的沉降时间，表现出良好的磁响应性。

实施例5：微囊化原代肝细胞在肝衰竭类似血浆中耐受实验结果图

本实施例以原代肝细胞为种子细胞，使其微囊化后在肝衰竭类似血浆中与平面培养的原代肝细胞进行比较，用相应试剂盒检测细胞上清液中相应物质分泌量和肝细胞对肝衰竭类似血浆中有害物质的代谢情况。

取6-8周龄，体重25±2g，C57小鼠(购自中国科学院上海实验动物中心)，按照文献所述胶原酶两步灌流法(潘君风.C57BL/6J小鼠肝脏不同细胞类群的分选及肝细胞蛋白质表达谱构建[D].西北农林科技大学,2011)分离得到小鼠原代肝细胞。对照组(即平面培养组)为上述原代肝细胞1x10⁶个使用常规方法培养，实验组(即微囊培养组)为等量上述原代肝细胞与1.8％海藻酸钠混合溶液充分混匀，微囊化后进行三维培养。两组细胞均置于37℃、5％CO₂培养箱中，细胞培养6孔板，2ml/孔肝细胞Lonza培养基(购自Lonza公司)培养。培养1天后，将两组培养基均换成肝衰竭类似血浆，2ml/孔，进行耐受实验，具体步骤参照文献(薛琨,高森,潘明新,高毅.模拟构建人肝衰竭血清对体外培养肝细胞功能的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,51:9601-9604)。分别于24h、72h取两组培养上清，用丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒、门冬氨酸转氨酶(AST)试剂盒、总胆红素(T-Bil)试剂盒、直接胆红素(D-Bil)、尿素氮(BUN)测试盒(脲酶法)(试剂盒均购自南京建成生物工程研究所)并按照试剂盒说明书所列方法检测上清中ALT、AST、TBIL水平，UREA分泌量。重复上述实验3遍，统计检验选择Student-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

实验结果显示，24h时，平面培养组和微囊培养组两组的ALT(A)、AST(B)、UREA(C)结果无明显统计学差异，但到了72h，微囊培养组ALT、AST(P<0.05)较平面培养组有下降，UREA(P<0.001)较平面培养组有升高。而，微囊培养组的TBIL(D)水平无论在24h(P<0.01)还是72h(P<0.05)均低于平面培养组，见图6。

实验结果表明，原代肝细胞在微囊化后，可以增强其抵抗肝衰竭类似血浆中有害物质的能力，显著降低ALT、AST水平，微囊化培养保护了肝细胞。微囊化培养可以保持原代肝细胞功能，合成能力(UREA分泌)和代谢能力(TBIL清除)均可长时间维持在一定水平。综上所述，原代肝细胞在微囊化后可更好的用于生物人工肝，清除肝衰竭病人血浆中的有害物质。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述的实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可以作出种种的等同的变型或替换，这些等同变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。