中国传统发酵食品中Enterolysin及Helveticin J基因多样性及抑菌活性研究

摘要

随着食品工业及食品国际贸易的日益扩大,国内外对食品安全问题也越来越重视,如何防止食品腐败变质显得极为重要,而目前市面上的防腐剂大多都是化学防腐剂,如果食用过量会对人体造成一定的损害,因此,像细菌素这类无毒无害的生物防腐剂的开发应用显得极具潜力。
　　乳酸菌细菌素是由乳酸菌产生的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质。在低浓度下就能对有害菌产生不可逆地杀灭作用。它们可被人体生物降解和消化,对健康无害。大部分乳酸菌细菌素仅对亲缘关系较近的菌株产生抑制作用,只有少数具有较广的抑菌谱。迄今为止,乳酸菌细菌素大致被分为三类:I类细菌素是羊毛硫抗生素,是小的肽类,翻译后修饰;II类细菌素是未经修饰的,热稳定的肽类;III类乳酸菌细菌素是目前乳酸菌细菌素中研究较少的一类,这一类细菌素属于大分子的,热不稳定的蛋白质类细菌素。目前,仅有五种III类的乳酸菌细菌素被描述过:Millericin, Enterolysin A(EnlA), Zoocin A, Lysostaphin and Helveticin J(HlvJ)分别由Streptococcus milleri, Enterococcus faecalis, Streptococcuszooepidemicus4881, Staphylococcus aureus, and Lactobacillus helveticus产生,本研究主要研究的是Enterolysin A(EnlA)和Helveticin J(HlvJ)。Lactobacillus helveticus481产生的Helveticin J是染色体编码的细菌素,具有较窄的抑菌谱,分子量37511Da,热不稳定,作用机制是杀菌;Enterolysin A是由Enterococcus faecalis LMG2333产生的热不稳定的蛋白,具有较广的抑菌谱,通过破坏敏感菌株的细胞壁来杀死细菌,根据已知文献报道,Enterolysin可以抑制乳杆菌、肠杆菌、枯草芽孢杆菌、单增李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌属等等,极具研究潜力。
　　中国有很多手工制作的传统发酵食品,一些发酵食品中富含丰富的微生物菌群,因此,这些发酵食品中的微生物菌群可以为细菌素基因挖掘提供良好的平台,然而,迄今为止,这方面的研究还很少。在这次研究中,通过使用不依赖培养的宏基因组技术来研究六种中国传统发酵食品中的Enterolysin及Helveticin J的多样性,并通过抑菌表达实验来研究它们的抑菌活性。
　　在本研究中,通过使用不依赖于培养的宏基因组方法对六种中国传统发酵食品中的Enterolysin和Helveticin J基因多样性进行研究,在NCBI数据库中检索已知的Enterolysin和Helveticin J氨基酸序列,用clustal W对其进行氨基酸序列比对,找到保守区域,用CODEHOP进行引物设计,通过PCR的方法在六种发酵食品样品中扩增Enterolysin和Helveticin J基因,PCR产物纯化后连接到pGM-T载体上构建成克隆文库并进行系统发育分析。实验结果显示,在4个克隆文库中
　　(DFE,RSE,GCE,QCE)扩增到Enterolysin基因(77-80aa),这些基因与NCBI中已知的氨基酸序列84％-96%相似,在系统发育树中聚集在同一个分支中;在5个克隆文库中扩增到Helveticin J基因(169-196aa),这些基因与NCBI中已知的氨基酸序列58%-100%相似。基于已经获得的Enterolysin和Helveticin J基因部分片段,选择2条Enterolysin基因序列和2条Helveticin J基因序列用基因步移的方法进行全长基因扩增。获得基因全长后,连接到pET-28a表达载体中并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。EnlA(DFE5)蛋白质分子量大小30.6kDa,经抑菌活性检测,能够抑制3种指示菌,其中包括致病性的单增李斯特氏菌属和金黄色葡萄球菌属。HlvJ(RS9)编码249个氨基酸,经抑菌活性检测,仅对瑞士乳杆菌有抑菌作用;EnlA(GCE11)蛋白质分子量大小25.3kDa,经抑菌活性检测后发现其对枯草芽孢杆菌,单增李斯特菌,金黄色葡萄球菌有一定抑制作用;HlvJ(RW21)蛋白质分子量大小36.7kDa,经抑菌活性检测后,仅对瑞士乳杆菌有轻微的抑制作用。本研究不仅展示了将宏基因组技术应用于从复杂的食品样品中识别细菌素基因,同时也证实了中国传统发酵食品可以为细菌素基因的挖掘提供宝贵的平台,具有应用于食品工业的潜力。

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引言

1.1 细菌素简介

1.2 III类乳酸菌细菌素

1.3 大肠杆菌表达系统

1.4 宏基因组

1.5 研究目的和意义

1.6 研究内容

第一章 中国传统发酵食品中Helveticin J 和Enterolysin多样性的分析

1.1引言

1．2材料与设备

1．3实验方法

1.4 实验结果

1.5 总结

第二章 臭豆腐样品中Enterolysin全长序列的获得及表达载体的构建

2.1 引言

2.2 材料与设备

2．3 实验方法

2.4 结果与讨论

2．5 本章小结

第三章 乳扇样品中Helveticin J全长序列的获得及表达载体的构建

3.1 引言

3.2 材料与设备

3．3 实验方法

3.4 结果与讨论

3．5 本章小结

第四章 羊乳饼样品中Enterolysin全长序列的获得及表达载体的构建

4.1 引言

4.2 材料与设备

4．3 实验方法

4.4 结果与讨论

4．5 本章小结

第五章 酒酿样品中Helveticin J全长序列的获得及表达载体的构建

5.1 引言

5.2 材料与设备

5．3 实验方法

5.4 结果与讨论

5．5 本章小结

全文总结

科研期间的文章和会议

致谢

参考文献