黄酒发酵过程中微生物多样性的研究

摘要

黄酒是中国传统的酒种，作为世界三大酿造酒之一，黄酒的历史年数是较为古老的一种酒类。黄酒的酿造的历史同样很悠久，然而对其研究却缺乏足够广度和深度，这在一定程度上制约了我国黄酒工业的发展。黄酒是中国传统发酵食品之一，微生物在其过程中是否发挥其作用，是否互相产生作用也很难揭示，所以发酵业的发展与其他食品产业相比较为滞后，产品的质量安全也是一个要素。因此，黄酒也需全面开展微生态环境此方面的研究，建立完整的体系，了解其酿造发酵过程中的微生物多样性，也可提高黄酒的质量和安全性。近年来，研究微生物多样性的方法不再局限于传统技术，更多的运用一些非传统无需培养的分子生物学技术，对食品、土壤等进行全面的深入研究。 目前国内对黄酒的研究主要集中黄酒的色香味、发酵陈化、酒曲微生物等方面，对微生物的研究主要在真菌领域。由于在设计技术方法上存在局限和片面性，比较缺乏对其酿造过程中微生物群落结构的全面的研究分析。本研究对黄酒发酵过程中的浸米水、酒曲、前发酵液、后发酵液、过滤后清酒进行取样后运用合适的提取方法提取出基因组DNA，使用分子生物技术对每个阶段的菌种群落结构进行分析和鉴定，并分析发酵过程中的菌种变化规律，对各个阶段进行生理生化检测，结果显示： （1）对于浸米水、前酵液和后酵液、成品清酒的液态样品，在提取总DNA之前制成菌悬液的状态对提取基因组DNA较为适用。对于质地比较特殊的酒曲样品来说，多加入了前处理和不同破壁方法的步骤。 （2）黄酒发酵过程中的细菌群落数量呈现先上升后下降最后为平稳的趋势，真菌群落数量呈现先上升后下降的趋势。浸米水中群落结构相比其他几个工艺点较为简单，酒曲中群落结构相比其他较复杂，前酵样品与后酵样品之间群落结构存在差异。成品清酒的多样性均低于前、后发酵阶段。 （3）黄酒发酵过程中，Staphylococcus sp.（葡萄球菌）、Lactobacillus plantarum strain（植物乳杆菌菌株）、Enterobacter cloacae（肠杆菌）和Uncultured bacterium为五个工艺点共有的细菌菌种。Aspergillus oryzae为浸米水、酒曲和前酵液共有真菌菌种，未带入到后酵和成品清酒阶段。细菌Lactobacillus pentosus strain（戊糖乳杆菌菌株）和Uncultured bacterium出现于前四个阶段，未出现于成品清酒中。Saccharopolyspora sp.（糖多孢菌）是酒曲特有的细菌菌种。Saccharopolyspora gloriosa strain（糖多孢嘉兰）和Lactobacillus plantarum strain（植物乳杆菌菌株）是酒曲带入发酵阶段的细菌菌种，而Lactobacillus plantarum strain（植物乳杆菌菌株）在成品清酒中未发现；Absidia corymbifera和Emericella nidulans（小巢状曲菌）是浸米水带入到前酵和后酵阶段的真菌菌种，且Emericella nidulans存在于成品清酒中。Absidia idahoensis var. Thermophila是酒曲带入前酵阶段的真菌菌种，在后酵阶段并未发现。Actinomucor elegans（毛霉）出现于浸米水和酒曲中，之后的发酵过程未发现。发酵阶段存在的Absidia corymbifera、Stephanoascus ciferrii、Aspergillus fumigatus真菌菌种带入到成品清酒中。Aspergillus fumigatus为前酵液优势真菌。 （4）对酒曲样品使用高通量测序技术方法，多样性评估曲线结果显示酒曲中真菌多样性较为丰富，Ascomycota（子囊菌门）占比大于80％，Chytridiomycota（壶菌门）占比约10-15％，Zygomycota（接合菌门）占约5％，Basidiomycota（担子菌门）和一些未能检测出的真菌一起组成了酒曲中真菌群落结构。系统进化树和Heatmap图均显示酒曲的真菌群落有如下几个菌属：Saccharomyceta（酵母属）、Basidiomycota（担子菌类）和一些早期其他分支的真菌属目。酒曲中的优势菌为Eurotiales（散囊菌目）。 （5）五个工艺点的温度呈现先升高后降低的趋势，在后酵阶段直至成品清酒的阶段呈现出一定的起伏变化，变化幅度不大。在浸米水阶段，温度逐渐升高，pH逐渐下降；在发酵阶段，pH值随着酒精度的升高而略微升高，最后呈现平稳的态势。整个发酵阶段的pH值降低的趋势最后达到一个平稳的范围内，酒精度在发酵阶段内，是逐渐升高的趋势。

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第一章 引 言

1.1 黄酒的的酿造以及发酵工艺

1.2 发酵食品中微生物多样性研究的进展

1.3聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术

1.4 DNA提取

1.5 目前的研究进展

1.6 研究内容和意义

第二章 黄酒发酵过程中各工艺点总DNA提取方法的研究

2.1 实验材料方法

2.2 结果与讨论

2.3 本章小结

第三章 黄酒发酵过程中各工艺点中细菌PCR-DGGE分析

3.1实验材料与方法

3.2 结果与讨论

3.3 本章小结

第四章 黄酒发酵过程中各工艺点真菌群落多样性分析

4.1实验材料与方法

4.2 结果与讨论

4.3本章小结

第五章 黄酒酿造过程中理化性质变化研究

5.1实验材料与方法

5.2 结果和讨论

5.2 本章小结

第六章 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

参考文献

致谢