桑黄菌种的诱变对其菌丝活力和代谢产物影响的研究

摘要

桑黄Sanghuangporus.Sanghuang是一种珍稀药用真菌，富含多糖、黄酮等活性物质，且具有非常显著地药理活性。目前对于桑黄的研究日益增多，市场需求量也急剧增加，不论是科学研究还是工业生产都离不开优良的桑黄菌种。通过诱变育种技术来提高桑黄菌株的活性和产量具有非常重要的意义。而目前对于桑黄诱变的研究较少，诱变方法相对单一。本文通过对桑黄菌株多种生理生化指标的测定分析，建立了一种优良菌株的筛选方法，筛选获得优良菌株SH1。以SH1为出发菌株，通过合理的物理诱变，选育获得4株优良的突变菌株，分别为A130、A157、A67，U119，并对菌株诱变前后代谢产物的产量及活性进行了相关研究。 本论文共分为六个部分，主要研究结果如下： 1）桑黄衰退菌株的筛选 对10株桑黄菌株进行了色度培养基（LBL）脱色能力评价及可见光谱分析，探究了LBL法脱色率与菌株液体传代发酵生物量、黄酮含量及清除自由基活性的相关性，证实了LBL法快速鉴定桑黄衰退的菌株的可行性。 2）桑黄菌株活力评价及优良菌株筛选 LBL法对桑黄衰退菌株的筛选具有简单、快捷等优点，但是脱色率较高的菌株之间，很难比较它们的优劣，因而缺乏一种能对桑黄菌株进行全面分析，从而筛选出最优菌株的方法。 为了解决上述问题，本章以活性较好的7株桑黄菌株为出发菌株，通过进行菌株生长活力、菌株抗氧化能力等多种生理生化指标的测定分析，确定了有效评价桑黄菌株活力的方法，筛选出了一株抗氧化能力强、生物量高产的优良菌株SH1，并通过相关性分析建立了一种桑黄优良菌株筛选的方法。 3）桑黄原生质体制备条件的确定 通过试验确定桑黄原生质体制备的最佳条件为：酶解体系1%溶壁酶+0.25%崩溃酶，酶解时间3 h，菌丝体菌龄8 d，酶解温度30℃，通过此体系制备原生质体，原生质体浓度可以达到6.9×106个/mL；原生质体最适再生培养基为改良PDA再生培养基，桑黄原生质体的再生率可以达到0.43%。 4）桑黄原生质体诱变方法及比较 通过试验对3种诱变方法的最适诱变剂量进行了确定，紫外诱变最适剂量为：紫外灯功率15 W，照射距离20 cm，照射时间8 s；60Co辐照诱变最适剂量为：150 Gy；ARTP诱变最适条件为：处理功率120 W，气流量为8 SLM，处理距离2 mm，处理时间30 s。 在最适诱变剂量下，对三种诱变方法的存活率、正突变率、变异率进行比较。60Co诱变的效果最差，原生质体再生存活率、正突变率都较低；UV和ARTP正突变率相近，但是与紫外诱变相比ARTP诱变技术具有更广阔的突变谱，更适宜进行优质菌株的选育。 对ARTP和UV复合诱变的条件进行了摸索，ARTP诱变20 s+紫外诱变4 s具有最佳的诱变效果。 5）桑黄突变菌株的筛选及鉴定 按照建立的筛选方法，对1139株诱变菌株进行菌丝生长速度测定、传代稳定性测定、摇瓶生物量及SOD酶和ACP酶酶活测定，获得了4株优良菌株A130、A157、A67、U119。这4株菌株与出发菌株SH1产生了明显的拮抗反应；RAPD分析证实了诱变菌株在分子水平上与出发菌株发生显著变化；HPLC分析从代谢产物角度证实了菌株的遗传物质发生改变。 6）诱变对桑黄菌株活性的影响 从代谢活性物产量、对自由基的清除作用以及对肿瘤细胞的抑制作用三个方面对优良诱变菌株进行研究，探寻诱变对菌丝活性的影响。试验结果表明，诱变之后四株菌株的代谢活性物质有不同程度的提升。A130、A157、A67、U119四株菌株多糖含量分别提升了34.55%、4.74%、67.95%、13.76%；黄酮含量分别提升了50.15%、48.25%、46.76%、45.07%.；A130菌株黄酮产量达到0.502 g/L，A67菌株多糖产量达到3.56 g/L。 4株菌株对自由基的清除能力和对肿瘤细胞的抑制作用，都有不同程度提升。证实了诱变可提高菌株的活力。

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第一章 引 言

1.1桑黄的主要活性物质及药理活性

1.2菌株质量评价及退化菌株的筛选

1.3食用菌诱变育种技术的发展

1.4课题目的意义及研究内容

第二章 LBL法评价筛选桑黄退化菌株的研究

2.1材料与方法

2.2结果与分析

2.3本章小结

第三章 桑黄菌株活力评价及优良菌株筛选

3.1材料与方法

3.2结果与分析

3.3本章小结

第四章 桑黄原生质体制备与诱变方法的初步研究

4.1材料与方法

4.2结果与分析

4.3本章小结

第五章 桑黄菌株的诱变以及优良菌株的筛选

5.1材料与方法

5.2结果与分析

5.3本章小结

第六章 诱变菌株代谢产物及活性分析

6.1材料与方法

6.2 结果与分析

6.3本章小结

全文总结

参考文献

本文创新点

本文不足与展望

附录

致谢

硕士期间主要学术成果