妇科肿瘤组织及血浆中mtDNA突变与细胞凋亡基因表达的研究

摘要

目的：旨在研究实体瘤患者原发性肿瘤及血浆中mtDNA突变和BCL-2、BAX、CASPASE基因的表达，探讨mtDNA突变对细胞凋亡的影响及其在肿瘤发生、发展中的作用，并有助于阐明肿瘤发生的分子机制，寻找新的有价值肿瘤标志物，为肿瘤的临床诊断、治疗以及预后的判断提供生物学指标和为抗肿瘤药物的研究提供新思路。 资料和方法：取32例妇科恶性肿瘤，8例妇科良性肿瘤患者的160份标本，包括肿瘤组织、瘤旁正常组织、外周血单个核细胞(peripherialbloodmonocytes，PBMC)及血浆标本进行研究，所有手术切除的标本均根据WHO标准进行病理学分型、分级及分期。病理类型包括子宫颈癌5例，均为鳞状上皮癌。子宫内膜癌10例(子宫内膜样癌3例，透明细胞癌1例，腺癌6例)。卵巢癌17例(浆液性囊腺癌9例，粘液性囊腺癌4例，混合性囊腺癌3例，透明细胞癌1例)。按FIGO手术一临床分期：早期(Ⅰ、Ⅱ期)19例，晚期(Ⅲ、Ⅳ)13例。按WHO组织学分级：Ⅰ～Ⅱ级24例，Ⅲ级8例。8例良性肿瘤中卵巢上皮瘤4例，子宫肌瘤4例。应用经典的酚、氯仿提取患者血浆、肿瘤组织及正常组织高分子量DNA，采用PCR-SSCP及DNA测序检测mtDNA突变。提取患者肿瘤组织及正常组织RNA，应用RT-PCR检测BCL-2、BAX、CASPASE基因的表达。 结果：1.mtDNA突变率：在32例妇科恶性肿瘤标本中，有22例出现32个基因位点的mtDNA突变，其中18例同时检测出mtDNA多态性改变，mtDNA突变率和多态性频率分别为68.8％(22/32)和56.3％(18/32)。在8例良性肿瘤标本中，有3例出现4个位点的mtDNA突变，4例出现6个位点的mtDNA多态性改变，mtDNA突变率和多态性频率分别为37.5％(3/8)和50％(4/8)。mtDNA突变率在恶性肿瘤及良性肿瘤组的差异有显著性(P＜0.05)。在不同种类的妇科恶性肿瘤中，mtDNA突变率和多态性频率分别为：宫颈癌80％(4/5)和60％(3/5)，子宫内膜癌60％(6/10)和40％(4/10)，卵巢癌70.6％(12/17)和64.7％(11/17)。 2.mtDNA突变热点：在发生于恶性肿瘤的32个突变中，有5个(15.6％)位于ND1基因区，7个(21.9％)位于ND4基因区，3个(9.3％)位于ND5基因区，11个(34.3％)位于CoⅡ基因区，16个(50％)位于cytb基因区。在发生于良性肿瘤的4个突变中，1个(25％)位于ND4基因区，3个(75％)位于cytb基因区。结果表明，mtDNA的突变热点位于cytb基因区，该基因突变频率最高，其次属CoⅡ基因。 3.mtDNA多位点突变：在mtDNA突变的22例中，仅有一个基因突变者8例，包括ND1基因突变1例，cytb基因突变3例，CoⅡ基因突变4例；大部分63.6％(14/22)涉及到2个基因以上的突变。其中同时涉及2个基因突变者9例，包括ND5+cytb基因突变和ND1+cytb基因突变各1例，ND4+cytb基因突变2例，CoⅡ+cytb基因突变5例；同时涉及ND4+ND5+cytb三个基因突变者1例；同时涉及4个基因突变者3例，包括ND1+ND4+ND5+cytb基因突变1例，ND1+ND4+CoⅡ+cytb基因突变2例。 4.血浆标本中mtDNA突变：为了进一步了解血浆中mtDNA突变的情况，对肿瘤组织中发现mtDNA突变的患者，又进行了相应的血浆标本的PCR-SSCP分析，以PBMC作为自身对照。22例中有20例(90％)扩增到PCR产物，其中9例(45％)发现了与肿瘤组织中一致的阳性结果。 5.mtDNA突变与细胞凋亡基因表达的相关性：在mtDNA突变的22例中，20例(90.9％)同时检测到bcl-2的表达，而非突变组的10例中，bcl-2的表达率仅为50％。其差异有显著性意义(P＜0.05)。Bax及caspase基因在mtDNA突变组的表达率分别为27.3％和13.6％，明显低于非突变组的80％，差异均有非常显著性意义(均P＜0.01)。表明mtDNA突变与bcl-2表达呈正相关，而与Bax及caspase基因表达呈负相关。 结论：在妇科恶性肿瘤中存在mtDNA编码区的高频率变异，mtDNA总突变率为68.8％。在不同种类的妇科恶性肿瘤中，mtDNA突变率分别为：宫颈癌80％，子宫内膜癌60％，卵巢癌70.6％，提示mtDNA编码区变异与妇科恶性肿瘤的形成有密切关系，可能是妇科恶性肿瘤发生机制中的一个重要的核外分子遗传学改变。mtDNA的突变热点位于cytb基因区，cytb基因的突变可能会对线粒体的氧化过程产生显著的影响。mtDNA突变为多基因、多位点的突变，大部分(63.6％)涉及到2个基因以上的突变。良性肿瘤mtDNA突变率(37.5％)显著低于恶性肿瘤组，差异有显著性。表明良性肿瘤与恶性肿瘤的发生有着不同的分子学基础。mtDNA突变在肿瘤的病理类型、临床期别及组织学分级之间的差异无显著性，提示mtDNA变异可能是妇科恶性肿瘤形成中的一个早期现象，并持续存在于癌症演变的全过程。mtDNA突变与细胞凋亡基因表达亦具有一定的相关性，其与bcl-2表达呈正相关，而与Bax及caspase基因表达呈负相关。我们的结果证实，在血浆中不但可以成功的扩增到mtDNA基因组，而且可以检测到mtDNA突变。表明血浆mtDNA突变有可能成为一个有价值的肿瘤分子标记物而用于肿瘤的辅助诊断和判断复发、转移的有效的生物学指标。

目录

英文缩略语

前言

第一部分：妇科肿瘤组织及血浆中mtDNA突变的研究

实睑材料

实验方法

实验结果

一DNA提取及鉴定结果

三、PCR扩增靶基因

四、PCR产物的酶切鉴定

五、SSCP检测mtDNA突变

六、DNA测序结果

讨论

第二部分：妇科肿瘤组织中细胞凋亡相关基因表达的研究

实验材料

实验方法

实验结果

讨论

结论

参考文献

综述线粒体DNA突变与肿瘤发生及细胞凋亡关系研究进展

学习期间发表著作和文章

致谢