ERβ在乳腺癌细胞中的功能及其活性调节

摘要

ERβ是1996年kuiper等从大鼠前列腺和卵巢eDNA文库中克隆得到的一种新的雌激素受体(Estrogen Receptor),并将经典雌激素受体称为ER α.ERβ基因的染色体定位、组织分布、与配体结合特性等与ERα不同,提示它们可能具有不同的生物学作用.为了阐明ERβ与乳腺癌的直接关系,该研究首先成功构建ERβ真核表达载体,将ERβ转染至乳腺癌细胞株,用G418筛选,得到了ERβ过量表达的稳定转染细胞株,观察了在雌激素、雌激素受体拮抗剂4-OHT等作用下细胞的生长特点.结果表明,在无雌激素存在时,外源基因ER β在MCF-7细胞系中的表达对细胞的形态及生长速度无明显影响,但在雌激素存在时,稳定转染ER β的MCF-7细胞生长速度减慢.另外,与转染空载体细胞或亲本细胞MCF-7比较,转染ER β的MCF-7细胞对雌激素受体阻断剂4-OHT的抑制作用无明显差异.

目录

英文缩略词表

第一部分：前言

第二部分：材料与方法

1材料

1.1细胞株、菌株

1.2质粒

1.3分子生物学工具酶

1.4常用分子生物学试剂盒

1.5细胞培养和转染试剂

1.6免疫组化及Western Blot试剂

1.7免疫共沉淀试剂

1.8其它常规无机盐试剂

1.9大型仪器

2方法

2.1 载体的构建

2.2质粒的小量提取与纯化

2.3质粒的大量提取

2.4哺乳动物细胞的转染

2.5 Western blot分析

2.6结晶紫试验方法

2.7免疫共沉淀

2.8 GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

2.9抗体的制备

2.10 GST沉淀(pull-down)分析

2.11荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性测定

2.12 ERβ和转录活性的测定

2.13反转录PCR(RT-PCR)

2.14统计学方法

第三部分：ER β在乳腺癌细胞株中的作用研究

1引言

2结果

2.1 ER β真核表达载体的构建及其转录活性的测定

3讨论

4结论

5参考文献

第四部分：COBRA1抗体的制备及在乳腺癌细胞中的特性研究

1引言

2结果

2.1 COBRA1全长编码序列的PCR扩增

2.2重组质粒的酶切鉴定

2.3 GST-COBRA1的诱导表达

2.4 GST-COBRA1蛋白的纯化及其鉴定

2.5乳腺癌细胞株中COBRA1的mRNA表达水平的检测

2.6兔抗人COBRA1多克隆抗体制各

2.7 COBRA1蛋白在乳腺癌细胞株中的表达分析

2.8 COBRA1在乳腺癌细胞中的定位

2.9 COBRA1与BRCA1的内源性相互作用

3 讨论

4结论

5参考文献

第五部分ER β与COBRA1相互作用的研究

1引言

2结果

2.1 COBRA1对ER β转录活性的影响

2.2 COBRA1和ER β在体外的相互作用

2.3 COBRA1和ER β在体内的相互作用

3讨论

4 小结

5参考文献

第六部分总结

攻读博士学位期间发表的文章

综述一新的雌激素受体-ERB在乳腺癌中的研究进展

综述二HER2过表达与乳腺癌内分泌治疗临床疗效的关系

发表的论著一

发表的论著二

致谢