E12大鼠胚胎中脑前体细胞体外培养、移植治疗大鼠帕金森病模型的研究

摘要

20世纪70年代末，肯定的动物实验结果支持细胞替代疗法(CRT)能逆转成年大鼠实验性帕金森病(PD)的症状。随后的l临床研究也证实接受同种异体胎脑移植后，植入的多巴胺(DA)能神经元在PD患者脑内能存活、提高移植部位18F-多巴摄取能力和改善临床症状。但是，大量依赖人胚(部分报道每个病例需要使用6～8个胚胎)严重阻碍着PD患者CRT治疗的临床研究及其应用前景。而日渐成熟的细胞培养技术可以使细胞数量呈指数级扩增，可能在一定程度上减轻PD患者CRT治疗对胚胎供体的依赖程度，使其临床应用更具可行性。 本研究以大鼠为实验动物，利用细胞体外培养技术，将胚胎中脑前体细胞(MPC)在体外扩增培养后植入PD模型大鼠纹状体。通过观察MPc在特定培养条件下的扩增、分化能力，以及培养细胞植入宿主体内后在宿主体内的分化、成活情况和对宿主PD行为的影响，旨在探讨体外培养扩增的MPC作为PD患者CRT治疗供体的可行性。 第一部分 内侧前脑束毁损制作大鼠帕金森病模型 目的制作大鼠PD模型，探讨PD模型鼠“自发”性旋转的意义。 方法6．羟基多巴胺(6-OHDA)立体定向注射毁损单侧内侧前脑束(MFB)；术后定期进行旋转行为测定，免疫组织化学定性模型鼠中脑和纹状体酪氨酸羟化酶(TH)含量的变化。 结果(1)26只雌性SD大鼠中，20只阿朴吗啡诱导的旋转频率达到5转／min以上；(2)免疫组织化学测定结果显示毁损侧中脑黑质致密部(SNPC)DA能神经元消失，同侧纹状体缺乏富含TH的神经纤维支配，同侧中脑腹侧被盖区(VTA)DA能神经元明显减少； (3)17只模型鼠曾出现“自发”旋转行为，“自发”旋转表现为两种形式，一种呈短阵、高频率的旋转，方向同阿朴吗啡诱导的旋转方向相同，另一种为向毁损侧的相对恒定的低频率旋转。 小结6-OHDA立体定向注射毁损MFB制作大鼠偏侧完全损伤PD模型成功率较高，中脑SNPC的DA能神经元毁损完全，VTA的DA能神经元明显减少；模型鼠在多次药物的诱导旋转行为测定后常见的“自发”旋转多数是一种条件发射行为，与药物诱导的旋转方向一致。 第二部分大鼠胚胎中脑前体细胞培养的研究 目的通过胚胎MPC体外培养获取PDCRT治疗所需的DA能神经元。 方法取自E12鼠胚中脑腹侧的MPC悬液在添加bFGF的DMEM/F12/N2培养液中原代培养，鉴定培养细胞的增殖和分化能力。 结果在添加了10ng／mlbFGF的DMEM／F12/N2培养液中MPC增殖良好，体外培养5～7天后细胞数量扩增到培养前的9．782土0．047倍；培养液中撤去bFGF后细胞可分化成星形胶质细胞和神经元，其中绝大多数Tujl抗原标记阳性的神经元同时呈TH抗原标记阳性，培养细胞分化为DA能神经元比例约为24．34％(102/419)。 小结E12鼠胚MPC原代培养是获取DA能神经元的可靠途径，类似的细胞培养技术应用于临床可能缓解PDCRT治疗供体不足的秀店。 第三部分 大鼠胚胎中脑前体细胞培养、移植治疗大鼠帕金森病模型 目的研究原代培养的大鼠MPC作为PDCRT治疗供体的可行性。 方法PD模型大鼠19只，随机分为细胞移植组(n=9)、假移植组(n=5)和对照组(n=5)；定期测定移植前后各模型鼠阿朴吗啡诱导的旋转行为的变化，免疫组织化学定性供体细胞在宿主体内的存活和分化情况。 结果术后6周和16周，细胞移植组阿朴吗啡诱导旋转的相对频率与术前比较有显著差异；细胞移植组术后16周时的阿朴吗啡诱导旋转的相对频率平均值与对照组对应的相对频率平均值相比也有显著差异；供体细胞能在宿主体内分化为多突起的DA能神经元，在移植术后6个月时仍存活良好。 小结E12大鼠胚胎MPC原代培养细胞在植入PD模型鼠纹状体后能分化为多突起的DA能神经元，植入细胞能长时间成活并改善模型鼠阿朴吗啡诱导的旋转行为。

目录

前言

第一部分 内侧前脑束毁损制作大鼠帕金森病模型

第二部分 大鼠胚胎中脑前体细胞培养的研究

第三部分 大鼠胚胎中脑前体细胞培养、移植治疗大鼠帕金森病模型

结论

参考文献

致谢

附录：在校期间发表论文

综述：细胞替代疗法治疗帕金森病

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