GDSL家族嗜热酯酶EstL5的结构与功能研究

摘要

酯酶是一类可催化酯类水解生成相应酸和醇，或催化酸和醇缩合生成酯类的酶，它们在生命过程中发挥着重要的作用，同时在工业生产中拥有良好的应用前景。
　　本研究首次报道一个来源于Geobacillus thermodenitrificans T2的中度嗜热酯酶，EstL5，它是GDSL家族酯酶的新成员，更进一步的序列分析可将之归入SGNH亚家族。经过克隆、表达、纯化，我们获得了融合6His标签的重组EstL5蛋白。酶活检测发现，它的最适底物是短碳链羧酸酯类，对丁酸对硝基苯酯表现出最高的活性，对短链的甘油三酯类底物有较弱活性，同时对所有长链酯类不具任何活性。因此将EstL5定义为酯酶(esterase)而非脂酶(lipase)。另外没有检测到EstL5有硫酯酶或是磷脂酶的活性。理化性质测定结果显示，EstL5的最适反应温度为60℃，最适反应pH值为8.0;在0℃条件下仍有24％的酶活力;且在55℃保存12小时后保留100％的活性。EstL5可在多种有机溶剂和化合物环境中保持稳定。这些理化性质表明该酯酶具有较好的稳定性和宽泛的反应温度，为该酶的广泛应用提供了基础。
　　表达纯化了硒代EstL5，通过气相悬滴扩散法获得了晶体。收集了分辨率为3.0(A)的衍射数据，晶体的空间群为P43212，单个晶胞参数为a=b=101.48(A)，c=124.56(A)。通过单波长反常散射法确定了相位，并完成了硒代EstL5的结构解析。获得分辨率为2.79(A)的野生型EstL5的晶体，并以硒代晶体结构为模板通过分子取代法完成结构解析。经比较发现野生型EstL5与硒代EstL5的晶体结构几乎没有差别。EstL5的结构显示在其中心区域拥有5个平行的β折叠片，它们的两侧分别覆盖有α螺旋结构，结构特征与SGNH家族酯酶的典型结构特征相吻合。
　　序列分析和结构信息显示，EstL5的催化三联体由Ser63、Asp235和His238组成，其中负责亲核攻击的Ser63位于一个β折叠和一个α螺旋的连接处，而Asp235、His238位于靠近C末端的两个螺旋间的柔性环上，它们的空间位置非常接近。EstL5的“氧孔”结构由Ser63、Gly101、Asn133组成，它们互相之间的距离约在3.5(A)至6(A)范围内，属于松散型“氧孔”。单突变结果显示催化三联体和“氧孔”结构中任何一个氨基酸残基的突变都会极大地影响EstL5的活性。可推定催化三联体Ser-Asp-His对EstL5的酯酶活性起到关键作用，并且“氧孔”理论可用于解释其催化机制，“氧孔”形成的适宜的静电环境对催化过程起着重要作用。
　　本论文主要对EstL5的结构功能进行了研究。首次报道并克隆表达纯化了EstL5，测定了它的基本理化性质，解析了它的晶体结构，阐述了它的催化机制。这为EstL5将来进入应用领域打下了基础，同时也为将来EstL5的同源酯酶家族的研究提供有益的帮助。

目录

摘要

英文缩略词

1 引言

2 实验材料与试剂

2．1 实验材料

2．2 主要试剂、酶类

2．3 菌株和质粒

2．4 主要试剂配制

2．5 主要仪器设备

2．6 计算机软件及数据库

3 实验方法

3．1 EstL5的序列分析和克隆

3．1．1 EstL5的序列分析

3．1．2 制备大肠杆菌感受态细胞

3．1．3 原核表达质粒的构建

3．2 EstL5融合蛋白的表达与纯化

3．2．1 EstL5融合蛋白的表达

3．2．2 EstL5融合蛋白的纯化

3．2．3 SDS聚丙烯酰胺凝胶配制方法

3．2．4 超滤操作方法

3．2．5 纯化蛋白溶液浓度的测定

3．3 EstL5的酯酶活性测定

3．3．1 酯酶EstL5最适底物测定

3．3．2 酯酶EstL5最适反应pH值与最适反应温度条件测定

3．3．3 酯酶EstL5的热稳定性测定

3．3．4 酯酶EstL5在不同pH条件下稳定性测定

3．3．5 酯酶EstL5在不同盐组分或化合物条件下稳定性测定

3．4 结晶EstL5的表达纯化

3．4．1 EstL5的分子筛纯化

3．5 EstL5蛋白结晶条件的筛选和优化

3．5．1 EstL5蛋白结晶条件的筛选

3．5．2 EstL5蛋白结晶条件的优化

3．6 硒代EstL5的表达纯化

3．6．1 硒代EstL5的表达使用的M9培养基的配制

3．6．2 硒代EstL5的诱导表达

3．6．3 硒代EstL5的纯化

3．6．4 硒代EstL5的鉴定

3．6．5 硒代EstL5的结晶条件筛选

3．7 衍射数据收集和结构解析

3．7．1 防冻剂筛选

3．7．2 X-射线衍射数据的收集

3．7．3 硒代EstL5的结构解析

3．7．4 野生型EstL5的结构解析

3．7．5 EstL5与底物复合体的晶体筛选

3．8 EstL5的突变体构建与表达纯化

3．8．1 引物设计

3．8．2 突变体表达质粒的构建

3．8．3 突变体的表达纯化

3．8．4 突变体的酯酶活力测定

3．8．5 突变体的热稳定性简单测定

4 结果和讨论

4．1 EstL5的克隆纯化与活性检测

4．1．1 EstL5的序列分析

4．1．2 EstL5的基因克隆

4．1．3 EstL5的表达纯化

4．1．4 EstL5的酯酶活性测定

4．2 EstL5的结构解析

4．2．1 EstL5的晶体制备

4．2．2 硒代EstL5的晶体制备

4．2．3 衍射数据收集

4．2．4 硒代EstL5的结构解析

4．2．5 硒代EstL5模型质量分析

4．2．6 野生型EstL5的晶体结构解析

4．2．7 EstL5模型质量分析

4．3 EstL5的结构与催化机理

4．3．1 野生型EstL5与硒代EstL5的结构比较

4．3．2 EstL5的晶体结构分析

4．3．3 突变体的活性检测

4．3．4 EstL5的催化机制的讨论

4．3．5 复合体晶体筛选

小结

展望

5 综述 GDSL家族的结构功能研究及酯酶的分类和应用

参考文献

在读期间发表论文

致谢

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