以siRNA表达载体介导的RNA干涉法建立人细胞色素b5还原酶缺陷的细胞模型

摘要

NADH-细胞色素b5还原酶(简称b5R)是一种具有重要生理功能的氧化还原酶类，以胞浆可溶型和膜结合型两种形式存在于体内。b5R基因突变将导致隐性先天性高铁血红蛋白血症(RCM)。 本课题利用RNA干涉(RNAi)技术，应用网络在线软件设计并合成两条靶向人b5RmRNA的siRNA模板片段，分别将其克隆至经过改建、带有neo基因的pSilencer1.0-U6载体上，构建成siRNA真核表达载体pSib5R-1和pSib5R-2。重组载体通过酶切和DNA直接测序鉴定。分别将两种重组质粒脂质体转染法瞬时转染人肺成纤维细胞和BEL-7402肝癌细胞株，半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR分析b5RmRNA的表达抑制效率。结果显示，pSib5R-1对两种细胞b5R基因的表达无明显影响，pSib5R-2对成纤维细胞b5RmRNA的抑制率达81.7％，对BEL-7402细胞b5RmRNA的抑制率达60％，说明两种细胞b5R基因的表达均可被pSib5R-2介导的RNA干涉有效抑制。 对pSib5R-1、pSib5R-2转染的BEL-7402细胞，采用G418进行筛选，共获得共获得18个细胞克隆：其中空载体5个，pSib5R-15个，pSib5R-28个。经PCR鉴定证实，各个克隆均稳定整合有重组载体或空载体。对各稳定转染的细胞克隆在b5RmRNA水平、酶活性、酶含量等方面进行干涉效果的鉴定，结果显示，pSib5R-2转染的克隆中有两个克隆b5RmRNA抑制率达48.2％和56.2％；酶活性抑制率为38.4％和48.5％；酶含量也有明显降低。对b5R酶缺陷的细胞克隆采用MTT法测定细胞的生长曲线，发现b5R酶缺陷没有改变细胞的生长速度。采用MTT法，通过不同浓度的丝裂霉素以及丝裂霉素处理后的不同时间点对b5R酶缺陷和正常的BEL-7402细胞的生长抑制率进行比较，发现b5R酶缺陷并没有降低丝裂霉素抑制BEL-7402细胞的敏感性。 本研究成功构建了b5RsiRNA表达载体，建立b5R酶缺陷的BEL-7402的细胞模型，为进一步研究b5R基因的功能以及探讨Ⅱ型RCM的发生机制提供了实验依据和材料，同时也为将来建立b5R缺陷的实验动物模型和相关遗传病的基因治疗打下了基础。

目录

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英文缩略词表

摘要

前言

第一部分 针对人NADH-细胞色素b5还原酶基因表达的siRNA表达载体的构建及鉴定

材料和方法

结果

讨论

第二部分 siRNA表达载体介导的b5R缺陷细胞模型的建立

参考文献

NADH-细胞色素b5还原酶缺陷的研究进展

致谢