应用荧光共振能量转移技术研究Dok分子的异源及同源相互作用

摘要

蛋白质作为细胞生物学功能发挥的主要承担者，其相互作用的研究已经成为认识蛋白质功能的一条重要途径。接头蛋白Dok是一类存在于胞浆中的与酪氨酸激酶相关的信号分子，可以作为PTK或RTK的直接底物分子而被磷酸化。文献报道接头蛋白往往通过自身寡聚化或异源结合发挥其生物学作用。Dok1、Dok2的同源及异源结合已有文献报道，目前尚不清楚Dok家族其它成员是否也存在自身寡聚化或异源结合现象。本文首先成功建立了FRET检测系统；在此基础上检测到Dok5分子、Dok1分子都可以在活细胞内发生自身相互作用，产生寡聚化，且在细胞周边更为明显；Dok1分子和Dok5分子在活细胞内可以发生异源结合；Dok1分子的PH结构域、PTB结构域对于Dok1分子的同源寡聚化及Dok1-Dok5异源聚合都有重要的影响；Dok5的PH结构域、PTB结构域及羧基末端均参与了同源寡聚化，其中PH结构域对Dok5自身相互作用起关键作用。 研究背景和目的：随着后基因组时代的来临，蛋白质的功能研究日益受到科研工作者的关注。蛋白质作为细胞生物学功能发挥的主要承担者，其相互作用的研究已经成为认识蛋白质功能的一条重要途径。 接头蛋白是一类位于胞内，联系信号转导通路中的各个信号分子的蛋白质，它可以将多个相互作用的蛋白分子募集在一起，从而形成一个大的信号转导复合体。接头蛋白Dok(downstreamoftyrosinekinase)是一类存在于胞浆中的与酪氨酸激酶相关的信号分子，可以作为PTK或RTK的直接底物分子而被磷酸化。Dok含有多个与其它分子相互作用的结构域或氨基酸基序，例如PH结构域、PTB结构域等，具有典型的细胞内分子接头特征。Dok分子可以参与调节细胞的生长、分化、增殖、迁移等一系列的生物学功能。现已发现的六个Dok同源家族成员中，Dok5主要表达在神经系统(如神经管，背神经节等等)，可以参与介导神经营养因子受体RET、TrkB等的信号转导。 接头蛋白往往通过自身寡聚化或异源结合发挥其生物学作用。2001年，Zhou等人应用GST-pulldown方法检测到Dok1可以发生自身寡聚化现象。2004年，Bedirian等人同样以GST-pulldown的方法检测到了Dok1与Dok4的异源结合。2005年，Dok2分子的同源结合以及与Dok1的异源结合也通过GST-pulldown及免疫共沉淀的方法得到了证实。目前尚不清楚Dok家族其它成员是否也存在自身寡聚化或异源结合现象。以上如免疫共沉淀，GST-pulldown等等这些技术方法主要建立在生物化学、分子生物学基础上，都是在特定的实验条件下，对固定的、破碎的细胞进行研究得到的，尚难以反映在活细胞内是否存在Dok分子的同源及异源结合。 随着物理光学技术的发展，荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)技术逐渐受到广大研究人员的青睐。荧光共振能量转移是一种物理现象，即当一个荧光团(供体)处于激发状态，会将其能量传递给相邻的分子(受体)，引起受体的激发，这个过程被称为F(o)rster共振能量转移(F(o)rsterresonanceenergytransfer)。大多数情况下，受体也是一个荧光分子，因此也称为荧光共振能量转移。由于能量转移效率对供体、受体之间距离的依赖性，使得人们可以利用FRET现象来分析两种分子之间、或单一分子内两亚基之间的相互结合。FRET技术现在已经成为研究活细胞内两种蛋白质分子是否具有直接相互作用的较为理想的方法。 本课题目的之一就是建立FRET检测平台，使之有效的对活细胞内蛋白质之间的相互作用进行检测。在此基础上，检测Dok5、Dok1分子在活细胞内的同源与异源相互作用，并同时分析Dok5、Dok1分子的各个结构域对于同源及异源相互作用的影响，从而深入认识Dok分子发挥生物学作用的结构基础。 方法：FRET检测系统的建立。成像系统包括OlympusIX71倒置荧光显微镜、cascade512F专业CCD(Roperscientific，Inc.)、双通道装置及85W氙灯光源(100W汞灯光源)，所有以上硬件均由IPP(Image-pro(R)plusversion5.0.1software，MediaCybernetics)软件控制。Dok5突变体的构建。应用PCR技术构建Dok5缺失突变体目的片段，再应用核酸电泳、质粒胶回收、质粒DNA双酶切、细菌转化、质粒DNA抽提等技术构建YFP融合质粒，使之表达出发射YFP荧光的融合蛋白。其余质粒为本实验室储备。哺乳细胞转染。以DMEM+10％胎牛血清培养Cos7细胞，应用lipofectemine2000按照试剂说明书步骤进行转染。荧光光谱检测。进行质粒转染前24小时将Cos7细胞接种于12孔板内，共转相同浓度的YFP-或CFP-融合质粒，24小时后以PBS清洗三次，胰酶消化，以PBS制成细胞悬液。采用TRIAX180光谱仪(JobinYvon)进行光谱检测，分别以488nm、502nm激光激发获得目的融合蛋白光谱，后用OriginPro7.0对光谱信息进行分析。FRET成像分析。室温条件下分别依次通过FRET通道、CFP通道及YFP通道成像。各通道参数分别为：YFP通道(激发，500/25nm；接收，545/35nm)、CFP通道(激发，440/21nm；接收，480/30nm)、FRET通道(激发，440/21nm；接收480/30nm和535/26nm。应用binning2×2模式，曝光时间为200ms。在进行FRET计算之前，应先将每幅图片中的背景荧光减去。之后应用以下公式在像素对像素基础上对整幅图片进行计算： FRETC=FRET-(0.773×CFP)-(0.071×YFP)其中FRET、CFP及YFP分别为共表达YFP和CFP融合蛋白的细胞通过FRET、CFP及YFP通道所成像去除背景后荧光平均强度。0.773和0.071分别是CFP和YFP荧光漏至FRET通道的漏过系数。 在进行统计分析时，根据文献(EricksonMG，etal.2001；EricksonMG，etal.2003)我们采用FRET比例(FRETRatio，FR)进行统计作图。 FR=(FRET-0.773*CFP)/0.071*YFP数据统计：所有的数据结果以平均值±标准误来表示。而各组之间差异性统计应用t检验进行分析。 结果：FRET检测系统YFP漏过系数为0.071，CFP漏过系数为0.773；阴性对照(YFP+CFP)FR=1.02±0.045，阳性对照(CFP-YFP)FR=3.83±0.078；Dok5分子之间在活细胞内存在较强的FRET信号，且其自身相互作用在细胞周边更为明显。其FR=2.76±0.049；Dok1分子之间在活细胞内也会产生FRET信号，FRET信号定位与Dok5相似。FR=1.68±0.056；Dok1与Dok5之间可以产生微弱的FRET信号。FR=1.36±0.039；Dok1分子PH结构域、PTB结构域缺失后，Dok1-YFP与Dok1-CFP之间FRET信号消失，Dok1-YFP与Dok5-CFP之间FRET信号也消失，而Dok1分子羧基末端缺失后，Dok1-YFP与Dok1-CFP之间以及Dok1-YFP与Dok5-CFP之间仍然可以产生FRET信号；Dok5分子的PH结构域缺失后，Dok5-YFP与Dok5-CFP之间FRET信号消失；而Dok5分子的PTB或COOH缺失后，突变体与Dok5-CFP之间的FRET信号有所下降，但仍然可以产生明显的FRET信号；光谱分析结果表明，Dok5-YFP与Dok5-CFP、Dok1-YFP与Dok1-CFP、Dok1-YFP与Dok5-CFP都可以产生FRET信号，集群细胞水平FRET检测与单细胞水平检测结果一致。 结论：成功建立了FRET检测系统，可以运用这一系统有效地对活细胞内蛋白质之间的结合进行检测；Dok5分子、Dok1分子都可以在活细胞内发生自身相互作用，产生寡聚化，且在细胞周边更为明显；Dok1分子和Dok5分子在活细胞内可以发生异源结合；Dok1分子的PH结构域、PTB结构域对于Dok1分子的同源寡聚化及Dok1-Dok5异源聚合都有重要的影响；Dok5的PH结构域、PTB结构域及羧基末端均参与了同源寡聚化，其中PH结构域对Dok5自身相互作用起关键作用。

目录

文摘

英文文摘

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英文缩写表

摘要

1 前言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

全文小结

致谢

参考文献

运用荧光共振能量转移技术在活细胞中实时检测信号转导过程