羧酸类化合物DJ5抑制肾囊肿形成的作用和机制

摘要

研究背景及目的：
　　 多囊肾病(polycystic kidney disease，PKD)是以多个肾小管上皮细胞形成、液体充满囊泡为特征的疾病，囊肿多发于肾小管和集合管，上皮细胞过度增殖是其致病的主要原因。常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)是多囊肾病中最为常见的类型。ADPKD是最常见的单基因遗传性肾病，它的发病率约为1/400-1/1000,全世界约有一千三百万患者。据USRDS2010年统计的结果，ADPKD在引起终末期肾病原发病中排第四位，仅次于糖尿病肾病、高血压肾病和原发性肾小球肾炎。50％患者在60岁时进展至终末期肾病。ADPKD除了累及肾脏以外，还可引起肝脏囊肿、胰腺囊肿、脾囊肿、颅内动脉瘤、心瓣膜病和结肠憩室等肾外病变。该病患者家系代代发病，子代患病概率为50％，尚有5％-20％自发突变患者。
　　 多囊肾病的治疗一直是困扰着广大肾科医生的一个难题，对于遗传性疾病，基因治疗无疑是最理想的选择，然而ADPKD的两个致病基因pkd1和pkd2较大，载体导入困难；此外，由于基因治疗的靶向等一系列问题尚未得到解决，所以尚无相关报道。迄今，ADPKD治疗关注更多的是药物，如mTOR抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、血管加压素V2受体拮抗剂、生长激素类似物、金属蛋白酶抑制剂等被用来研究治疗多囊肾病，且进入临床试验阶段，但由于这些药物在治疗多囊肾病方面仍存在争议，因此尚没有一个能够获得公认对多囊肾病有特效的药物上市。
　　 前期研究发现过氧化物酶体增生物激活受体(PPARγ)对多囊肾动物模型有治疗作用，但有明显的心脏毒副作用，考虑到多囊肾病是一种需要长期药物治疗慢性疾病，用药的安全性是ADPKD药物研发中的十分重要问题。我科与中科院上海药物研究所沈建华教授课题组合作，研制多种非TZD类PPARγ激动剂，即新型羧酸类过氧化物酶体增生物激活受体激动剂，通过对其化学结构的改造，希望能够保留其治疗多囊肾病作用的同时减少其毒副作用。我科熊锡山博士曾对这些化合物通过不同肿瘤细胞以及成瘤小鼠模型进行筛选，发现其中的DJ5能够抑制肿瘤细胞增长并且对肿瘤负荷裸鼠的瘤体有明显缩小的作用，但PPARγ激动活性很弱。基于DJ5抗肿瘤作用，本课题进一步探索对ADPKD的治疗作用，采用人肾囊肿衬罩上皮细胞系WT9-12和肾囊肿模型斑马鱼作为对象，观察其药效，并探讨其发挥肾脏保护作用的机制。
　　 方法：
　　 1、繁育和鉴定hi459/scorpion、hi4166/pkd2斑马鱼，构建pkd2 morphant肾囊肿模型。在前述斑马鱼模型50％外包期时，予以DJ5药物干预，比较药物干预组与对照组产生躯干弯曲、左右不对称缺陷和肾脏囊肿的斑马鱼数量；
　　 2、采用干预3天后的斑马鱼胚胎制片，HE染色、全胚胎免疫荧光技术观察DJ5干预组与对照组肾小球及肾管形态学差异；
　　 3、Western blot技术分析pkd2 morphant斑马鱼DJ5干预组及对照组p-Akt表达情况；
　　 4、MTT方法检测DJ5不同浓度(0、12.5、25、50、100、200μmol/L)对人肾囊肿衬里上皮细胞系WT9-12的增殖抑制作用；
　　 5、LDH释放实验检测DJ5不同浓度(0、12.5、25、50、100、200μmol/L)对人肾囊肿衬里上皮细胞系WT9-12的细胞毒性作用；
　　 6、Western blot技术分析DJ5不同浓度(0、25、50、100μmol/L)干预后的人肾囊肿衬里上皮细胞系WT9-12的Akt及其活化形式p-Akt和Akt下游分子FoxO3a及其p-FoxO3a的表达；
　　 7、流式细胞术检测DJ5不同浓度(0、25、50、100μmol/L)干预后的人肾囊肿衬里上皮细胞系WT9-12的细胞周期和细胞凋亡的变化；
　　 8、Western blot技术分析DJ5不同浓度(0、25、50、100μmol/L)干预后的人肾囊肿衬里上皮细胞系WT9-12的周期及其调控蛋白P21CIP/WAF1、cyclin A的表达；细胞凋亡及其标志蛋白PARP的裂解。
　　 结果：
　　 1、hi459/scorpion斑马鱼DJ5干预组肾囊肿出现的比率为15.41％，对照组肾囊肿出现的比率为23.39％；hi4166/pkd2斑马鱼DJ5干预组躯干弯曲、右位心比率较对照组均有一定改变；pkd2 morphant斑马鱼对照组发生肾囊肿的比率为33.28％，而DJ5干预组肾囊肿出现的比率为10.23％，且HE染色及全胚胎免疫荧光可观察到DJ5干预组肾小球及肾管结构较对照组相比得到改善；Western blot方法检测显示DJ5干预组较对照组斑马鱼72小时胚胎组织p-Akt表达明显降低。
　　 2、DJ5可抑制WT9-12细胞增殖，这种增殖抑制效应以浓度100μmol/L时最为显著，且呈现剂量和作用时间依赖性；DJ5浓度200μmol/L时LDH释放量显著增加，而低于100μmol/L时与对照组相比无明显差异；
　　 3、Western blot方法检测DJ5能够下调p-Akt、p-FoxO3a表达，上调FoxO3a表达，Akt表达变化不明显；
　　 4、DJ5干预WT9-12细胞，使其阻滞在S期，并且可以上调周期抑制蛋白P21CIP/WAF1表达，下调周期蛋白cyclin A表达；DJ5100μmol/L处理组能够促进WT9-12细胞发生凋亡，并且western blot检测发现在100μmol/L给药组PARP蛋白89kd活性片段表达增加。
　　 结论：
　　 本课题采用斑马鱼为实验动物进行DJ5治疗ADPKD的药效学及作用机制的研究，发现DJ5能够显著减少斑马鱼肾囊肿的发生率；且证明其可以通过降低Akt活化形式p-Akt的表达，抑制对下游信号分子FoxO3a的磷酸化，促进FoxO3a发挥生物学作用，从而有效抑制囊肿衬里上皮细胞增殖。DJ5可以使WT9-12细胞阻滞在S期，诱导细胞发生凋亡从而发挥抑制增殖的作用。本研究为多囊肾病的治疗提供了实验基础和理论依据，具有重要的临床价值和现实意义。