恶性疟原虫野生株致病相关基因的转录调控研究

摘要

疟疾目前仍然严重危害人类的健康，全球每年死于疟疾的人数超过一百万。在感染人体的四种疟原虫中，恶性疟原虫感染可引起重症疟疾，包括脑型疟和妊娠相关性疟疾。导致重症疟疾的病理基础是恶性疟原虫感染的红细胞(iRBC)粘附血管内皮细胞继而堵塞脑部毛细血管或黏附在子宫毛细血管部位。研究已经表明，这种黏附作用主要是由一种被称为恶性疟原虫红细胞膜蛋白1(PfEMP1)的分子介导的，该分子能与宿主体内20多种受体分子结合，是恶性疟原虫关键的致病因子。
　　 PfEMP1蛋白是由恶性疟原虫var基因家族编码的产物，该基因系变异基因家族，在恶性疟原虫3D7株基因组中含有约60个var基因，分布在不同染色体的亚端粒或中间位置上。Var基因的结构包括启动子区(5' UTR)、外显子Ⅰ、内含子、外显子Ⅱ和下游调控区(3'UTR)。根据上游肩动子序列的不同，这60个var基因又可分为5个亚类:10个upsA亚类、35个upsB亚类、13个upsC亚类、1个upsD亚类(var假基因)和1个upsE亚类。大量现场和实验室的研究表明，var基因转录的类型与恶性疟原虫的致病力（毒力）密切相关。基于恶性疟原虫3D7标准株的研究表明，var基因的表达具有“排他性”，即var基因家族每次只有一个获得表达，剩余成员都处于沉默状态，从而保护其有限的PfEMP1抗原库不被人体免疫系统完全识别。大量研究已证明，这种排他性表达主要受到基因转录水平上的调控，其机制涉及细胞核内结构、染色质修饰、非编码区等表观遗传学因素。而且恶性疟原虫的var基因能够进行表达更替(expression switching)，通过这种“克隆变异”机制不断改变其所寄生的红细胞膜表面抗原类型，从而在宿主体内实现免疫逃避。但是对于var基因表达更替的规律及其机制，目前尚无明确的结论。基于实验室虫株的研究显示，var基因的更替并非随机的，而是具有高度的有序性和保守性，起始优势的var基因决定了后续表达的var基因类型;此外，对于某个var基因，其转录上调或者下调的速率也是固定的。
　　 尽管var基因表达规律及其调控机制的研究一直是疟疾基础研究的热点，但是迄今这方面的研究成果大多来自实验室长期培养的虫株，如3D7标准株等。一些研究显示，恶性疟原虫经历体外长期培养后，由于寄生环境的改变和宿主免疫压力的缺失，导致某些虫体特征发生改变，包括被感染红细胞表面“knob”结构的消失、强毒力相关的upsA亚类var基因快速沉默等。这些现象提示，对实验室标准虫株var基因研究获得的相关结论未必能反映野生型虫株中的实际情况，因此，开展恶性疟原虫野生型虫株var基因转录表达机制的研究显得十分必要。但是由于不同虫株间var基因序列高度变异，同源性小于50％，给野生株var基因序列信息的获得带来了困难，阻碍了对恶性疟原虫野生株var基因家族的研究。对此，本研究选用中缅边境地区新分离的恶性疟原虫野生虫株，通过有限稀释克隆法获得野生虫株的克隆品系，并利用全基因组测序和var基因拼接获得野生型克隆的var基因序列。随后，我们依此设计每个var基因的特异性引物，用于检测和分析恶性疟原虫野生株的var基因转录变化规律，取得了以下研究结果:
　　 1.恶性疟原虫野生株FCYN0906的培养和克隆化
　　 恶性疟原虫野生株FCYN0906采集于中缅边境的拉咱市，液氮冷冻并用干冰保存运至实验室。按照标准的野生株复苏和培养方法，建立该虫株的体外连续培养。采用疟原虫有限稀释法，对该虫株进行克隆化:将原虫悬液稀释至每200微升0.01-0.5个原虫至96孔板，经过14至28天的培养，共获得了6个疟原虫克隆，分别定名为FCYN0906-4A、FCYN0906-4C、FCYN0906-4H、FCYN0906-5H、FCYN0906-6G和FCYN0906-6E。为确定这些克隆的基因型，我们利用本实验室先期建立的恶性疟原虫微卫星多态性分析的技术平台，选择8个代表性的微卫星位点，即ARA2、TA1、TA60、TA81、TA87、TA109、PfPK2和Polyα，采用半巢式PCR的方法，对6个克隆品系的基因组进行扩增，并利用Genscan方法检测各微卫星片段的长度。结果显示，克隆FCYN0906-4C、4H、5H和6G在这8个位点上的微卫星长度完全一致，表明这4个克隆属于同一基因型的克隆品系。而克隆FCYN0906-4A和6E，其微卫星长度在一些位点上与其他4个克隆不一致，提示其具有不同的基因型。因此本研究选用了恶性疟原虫野生株克隆FCYN0906-4C、4H、5H和6G进行后续研究。
　　 2.恶性疟原虫野生株克隆FCYN0906-5H的全基因组测序和var基因序列的组装
　　 基于上述微卫星检测结果显示4个疟原虫克隆具有相同的基因型，我们选用其中的FCYN0906-5H做Solexa全基因组测序。大量制备基因组DNA，并且通过检测18SrRNA排除宿主DNA的污染。全基因组测序共获得10，259，515对序列片段(reads)，读长为100bp。以已发布的3D7标准株基因组为参考序列，采用Bowtie2软件进行序列比对。结果显示，93.15％的序列能比对到3D7基因组上，平均基因组覆盖率达90倍。然而，由于不同恶性疟原虫之间var基因序列变异度很大，特别是var基因序列高变区，因此，能覆盖每条染色体上var基因可变区域序列的丰度很低，而覆盖var基因相对保守区域序列丰度较高。为解决该难题，我们采用VelVet软件对该野生型克隆的基因组数据进行了重新组装，选取了8281个长度大于500bp的序列重叠群(contigs)，围绕DBLα结构域进行var基因序列的拼接。
　　 首先，我们从NCBI数据库下载了所有的PfEMP1蛋白序列并建库，用8281个contigs与之做Blastx比对，共找到217个和PfEMP1相关的contigs，采用VarDom1.0Service预测结构域，包括N末端区(NTS)、Duffy样结合区(DBL)、富含半胱氨酸样区(CIDR)、酸性末端区(ATS)，结果找到DBLα相关的contigs66个，其中47个包含了DBLα最常见的相对保守蛋白序列DIGDI及PQYLR;对于另外19个contigs，我们根据其各自的DBLα高变区序列设计一条引物，结合该结构域的上游通用引物(DBLαAF)及下游通用引物(DBLαBR)，利用PCR扩增和测序，获得19个DBLα相关序列并与之前47个contigs拼接。最终，利用这66个contigs一共拼接出50个含有完整DBL6α结构域的序列。如前所述，根据var基因上游序列，可将var基因家族分为不同的亚类，对此，我们提取这50个contigs的上游序列进行亚类预测，并利用根据3D7株序列设计的upsA类、upsB类和upsC类var基因通用上游引物，PCR扩增出部分数据缺失的上游序列进行测序后加以验证。结果显示，这50个contigs中，有36个含有上游序列可以进行分类预测，另外14个未获得上游序列，但是其中2个DBLα序列(var84，var4)具有明显的upsA类特征，据此我们将50个contigs归类为:11个upsA类、18个upsB类、7个upsC类、1个upsD类和1个upsE类，剩下12个的分类未知。这50个contigs能够代表克隆FCYN0906-5H的var基因家族，其理由是:(1)已完成基因组测序的3D7标准株、HB3株及IT4株，其所有var基因一般均含有一个DBLα结构域，而我们拼接的50个var基因也都含有DBLα结构域，且进化树中能够与其他的DBL（β-ε）区分开;(2)这50个var基因中，有42个含有NTS结构域，另外4个也含有var基因5'端常见的DBLα-CIDRα结构。
　　 3.恶性疟原虫野生株各var基因特异引物的设计和扩增效率分析
　　 为研究恶性疟原虫野生株FCYN0906各个克隆的var基因转变规律，我们需要分别设计针对50个var基因的特异性引物用于荧光定量PCR(qRT-PCR)分析，检测每个var基因的转录水平。对此，我们根据克隆FCYN0906-5H的50个var基因DBLα高变区序列设计了相应的特异性引物。为验证各引物的扩增效率和特异性，我们将克隆FCYN0906-5H的基因组DNA连续10倍稀释后，检测引物的扩增效率，结果显示，这50对引物扩增效率为98％-100％，并且溶解曲线峰单一。由于上述微卫星结果显示FCYN0906-4C、4H、5H和6G的基因型一致，我们用这50对引物对4个克隆的基因组进行PCR扩增和测序，结果显示所有引物在FCYN0906-4C、4H和6G中均能有效扩增，序列分析结果显示这4个克隆var基因序列完全一致，这些结果进一步证实FCYN0906-4C、4H、5H和6G这4个克隆基因型的一致性。
　　 4.FCYN0906各个克隆var基因排他性表达分析
　　 基于恶性疟原虫3D7标准株的研究认为，var基因家族具有“排他性”表达规律，即每个疟原虫在其单个红内期周期内，只有一个var基因能获得优势转录和表达，我们一般称这个获得表达的成员为“优势var基因”。这种表达模式的一个合理解释是:保护恶性疟原虫最主要的表面抗原库（PfEMP1家族），避免其由于被宿主免疫系统完全识别而快速耗竭，这可能也是恶性疟原虫能够在人体内建立长期慢性感染的细胞学基础。由于缺乏完整的var基因家族序列，对野生型虫株var基因的研究还停留在利用基于DBLα保守区的通用引物进行PCR—克隆—测序以及频率分析，从而间接获得野生株中各个var基因的相对转录水平，因此在恶性疟原虫野生型虫株中var基因是否同样为排他性表达还未能加以证实。而本课题利用针对恶性疟原虫克隆FCYN0906-5H的50个var基因分别设计定量分析引物，对该野生株的var基因家族转录水平进行系统的定量分析。我们将冻存的克隆FCYN0906-4C、4H、5H和6G复苏后，进行严格的同步化处理，并收集环状体期的总RNA(10-15h)，去除基因组DNA污染后进行逆转录反应，获得cDNA后，用50对var基因特异性引物分别检测其转录水平。在复苏后20天检测，发现这4个克隆分别具有不同的优势var基因，其中4C株优势转录var167，占所有var基因转录水平的61％;4H株优势转录var15，占所有var基因转录水平的69％;5H株优势转录var51，占所有var基因转录水平的44％;6G株优势转录var47，占所有var基因转录水平的57％。在这4个克隆中，转录水平居于第二位的var基因仅占总转录水平的5％-13％。在3D7标准株中检测到的优势var基因所占百分比为40％-80％，由此可见，恶性疟原虫野生型克隆中的var基因家族也具有“排他性”表达的规律。
　　 5.FCYN0906各个克隆在体外培养过程中var基因转录变化规律的系统分析
　　 迄今为止，关于var基因家族的研究大多集中在其转录调控的分子机制上，但仍有少数研究对实验室虫株的var基因转录变化规律进行分析，结果显示，var基因的转变并非是随机的，而是具有高度的有序性和保守性。var基因家族的“排他性”表达及高度有序的更替是恶性疟原虫表面抗原“克隆变异”现象的重要分子基础。然而，对于var基因转录变化规律的研究，主要也是在3D7标准株中进行的，而野生型虫株的var基因家族序列信息不全，难以特异性地检测每个var基因的转录水平。鉴于野生型虫株与实验室长期培养虫株的显著差异，很有必要在野生型虫株中对该科学问题开展系统的分析。在本课题中，我们组装了野生型克隆FCYN0906-5H的50个var基因，并且设计了各自特异性的引物，从而可以对野生株var基因转录变化规律开展进一步的研究。于是我们将上述的4个野生型克隆培养物各自分成2个分瓶后进行平行实验，每间隔10代检测一次var基因转录谱的变化情况，共检测了5个时间点;同时，我们又对这4个克隆做了第二次完全独立的重复实验，保证实验过程及检测时间点与上一次实验一致。结果发现，起始优势var基因不同的4个克隆具有不同的var基因转录变化途径，表明起始优势var基因会影响接下来转录的var基因类型，如克隆4C起始优势转录的为var167，接下来得到优势转录的有var98，var143，var21，var45;而在克隆6G中起始优势转录的为var47，则接下来得到优势转录的为var136，var163，var21。令人感兴趣的是，同一克隆的4个不同分瓶之间，var基因的转录变化方向也不尽相同，表明野生型虫株中var基因的转变具有一定的随机性，如克隆4C的两个分瓶4C-C及4C-D在起始优势转录的var167逐渐下调后，都有var98，var21，var143的上调，但是分瓶4C-C选择优势转录var143，而分瓶4C-D则选择优势转录var21。同时我们发现，与实验室标准株不同，野生型虫株中单个var基因的转录上调或下调速率并不是固定的，如var98在分瓶4C-B中上调的速率高，能达到每代2.7％，而在分瓶4C-D中上调速率每代约0.3％，这种上调或者下调速率的可变性，同样造成了不同分瓶之间var基因变化方向的多样性。但是从整体上分析，这些来自于同一个野生株的克隆及其分瓶在var基因转录变化过程中，仍然具有一定的保守性，如克隆6G的分瓶6G-C及6G-D，都经历了var47的下调，var21，var136，var170的上调，最后都选择优势转录var163，其var基因转变的途径相当一致;var21不仪在多个克隆中成为最终的优势转录基因，而且在4个克隆var基因的各条转变路线中都起了重要的过渡作用，可能代表了野生株FCYN0906的一个偏好var基因。
　　 因此，我们认为，野生型虫株var基因家族的转录变化规律包含了两个层面:有序保守性及随机性。同时，起始优势var基因的类型、不同野生株偏好的var基因类型以及不同var基因成员的转录上调或下调速率特征影响了var基因的转变方向。
　　 此外，恶性疟原虫野生株在体外培养过程中，虽然大部分upsA类var基因的转录水平都很低，但偶尔还是有个别upsA类var基因的上调及优势转录，在无选择压力条件下，上调可能是随机的，不具有重复性。
　　 小结:本研究分离了我国云南边境地区一株恶性疟原虫野生株并建立了体外培养。通过单克隆的方法获得了该虫株的克隆品系。通过对其中一个克隆全基因组测序，拼接了其50个var基因，并根据上游序列将这些var基因分类。根据var基因高变区序列，设计了50对特异性引物，采用realtimePCR方法定量分析了该野生虫株4个克隆在体外培养过程中var基因转录类型及其转变规律，结果显示该野生虫株var基因仍为排他性表达，且4个克隆及同一克隆不同分瓶之间，var基因转变方向各不相同。本研究首次从单个var基因水平上系统分析了恶性疟原虫野生株中var基因的转录水平及其转变规律，首次提出了野生株中var基因转录上调与下调速率的可变性，并且根据我们的结果，提出var基因转变过程是随机性及保守性相结合的，而以往从实验室虫株中得出的关于var基因转变方向随机性或者保守性的结论都是片面的。根据已有的文献资料，结合本课题对恶性疟原虫野生株的研究结果，我们总结出恶性疟原虫var基因转录及转变规律如下:1）野生型克隆中var基因为排他性表达;2）var基因上调与下调的速率具有可变性，即优势var基因可继续保持优势转录，或迅速下调、缓慢下调，并被另一个优势转录的var基因取代;3）起始优势转录的var基因类型可影响接下来上调的var基因类型，且存在一定偏好性;4）起始优势的var基因在继续优势转录或者逐渐下调的过程中，其他var基因遵循一定的变化方向;5）起始优势的var基因下调后，有不同的var基因上调，接下来会随机选择其中一个var基因优势转录;6）大部分upsA类var基因处于沉默状态，但是会出现个别upsA类var基因上调及优势转录。本研究结果为阐明恶性疟原虫重要致病基因的转录调控机制提供了坚实的实验基础和新的研究方向。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一章 恶性疟原虫野生株FCYN0906 的体外培养及单克隆化

一、材料

二、方法

三、实验结果

四、讨论

第二章 恶性疟原虫野生株克隆FCYN0906-5H全基因组测序后var基因的组装及特异性引物的设计

一、材料

二、实验方法

三．实验结果

四、讨论

第三章 恶性疟原虫野生株在体外培养过程中var基因的排他性表达及转录变化规律

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

小结与意义

附表1 50个var基因结构域预测

附表2 var基因分类预测

参考文献

综述

发表论文和参加科研工作情况

致谢