恶性疟原虫海南株氯喹抗性相关基因多态性及msp3等位基因分型研究

摘要

疟疾广泛流行至今仍无法得到很好控制的原因主要有以下几点：出现抗药性虫株和对杀虫剂产生抗性的媒介蚊虫，缺乏适当有效的疟疾疫苗等。疟疾流行导致大量人口死亡，能够引发严重的社会经济问题，几乎成为所有热带和亚热带国家的沉重负担。在曾广泛使用的抗疟药——氯喹对抗药性恶性疟失去其治疗效果后，这一问题更加严重。尽管氯喹抗性产生的具体机制还不十分清楚，但已有研究表明三种食物泡膜蛋白——Pgh1蛋白、一个约330kDa的蛋白以及PfCRT蛋白——可能在氯喹抗性产生的过程中发挥重要作用；而它们的编码基因——pfmdr1基因,cg2基因和pfcrt基因已被成功克隆，并且测定了序列。此外，一些研究认为具有不同基因型的恶性疟原虫可能具有不同的致病性、抗原性及药物敏感性，而且，某些分子标记在疟疾分子流行病学研究上具有重要价值。本论文主要包含两个方面：一是恶性疟原虫海南株氯喹抗性相关基因的多态性分析，二是对恶性疟原虫海南株裂殖子表面蛋白3进行等位基因分型。 研究目的 了解海南省恶性疟原虫pfcrt基因和pfmdr1基因特定位点的多态性，进一步分析其多态性同氯喹抗性的关系；对恶性疟原虫海南株进行msp3等位基因分型，了解海南省恶性疟原虫种群的构成特征。 研究方法 用WHO推荐的体外微量法测定海南省恶性疟原虫虫株对氯喹的敏感性。 根据Genbank公布的恶性疟原虫pfcrt基因和pfmdr1基因序列设计引物，采用套式PCR分别扩增pfcrt基因编码第76位和第356位氨基酸的基因片段以及pfmdr1基因编码第86位、第1042位和第1246位氨基酸的基因片段。PCR产物分别用特定的限制性内切酶消化，分析其是否发生特定的点突变，并分析这些突变同氯喹抗性的关系。统计学分析抗性基因多态性同氯喹抗性的相关性。 设计针对msp3基因两种不同等位基因型的特异引物，采用套式PCR方法分别扩增msp3基因不同等位基因型的目的基因片段。 研究结果 42份采自海南省疟疾流行区恶性疟病人血样，经体外药物敏感性测试，22个为氯喹抗性株，20个为氯喹敏感性，总抗性率为52.38％。 Pfmdr1基因：在全部42个样本中，第86位点均为野生型，没有发生突变。42个样本中有8个发生了D1246Y突变，其中除一例混合感染为氯喹敏感株外，其余均为抗性株。在对pfmdr1基因第1042位点的检测中有37个样本扩增得到目的基因片段，有10个发生了N1042D突变，其中9个为氯喹抗性株，1个为敏感株。 Pfcrt基因：42个受试样本中，有30个(其中2个为混合感染)发生了K76T突变，其中18个为氯喹抗性株，12个为氯喹敏感株。第356位点未检测到突变，均为野生型。 Msp3基因：42个样本中有36个扩增得到目的基因片段，属K1等位基因型的有25个 (52.08％)，属3D7等位基因型有23个(47.92％)，其中同时扩增出两种等位基因片段的有12个，混合感染率为33.33％。 结论 海南省恶性疟原虫虫株pfcrt基因的K76T位点突变以及pfmdr1基因的N1042D位点突变和D1246Y位点突变同氯喹抗性具有统计学关系。而pfcrt基因的356位点和pfmdr1基因的86位点未发现具有多态性，与氯喹抗性不存在相关性。 海南省恶性疟原虫虫株msp3等位基因型以K1型略占优势，3D7型较少，两种不同等位基因型虫株的混合感染率不高。