人类免疫缺陷病毒1型Tat蛋白的结构改造及其颗粒性抗原的制备

摘要

人类免疫缺陷病毒(HIV)感染及其引起的艾滋病，是我国及全球所面临的重大公共卫生问题，严重危害人类健康。开发研制安全有效的HIV疫苗以及抗HIV药物是控制HIV感染及艾滋病流行的重要措施。
　　 HIV-1反式转录激活因子(trans-activator of transcription，Tat)是HIV-1在感染早期产生的一种重要调节蛋白，在病毒复制和感染致病中起重要作用。在HIV感染细胞内，Tat可反式激活病毒基因组转录的起始和延长，从而启动和促进病毒的复制。此外，分泌和释放至细胞外的Tat还具有多样的胞外活性，在艾滋病的免疫抑制、艾滋病脑病和Kaposi肉瘤形成等致病中发挥重要作用，被称为“病毒毒素”，也使得Tat成为HIV疫苗研究的重要候选抗原之一。
　　 已有研究表明，尽管天然Tat蛋白的序列在HIV-1不同亚型毒株间具有高度的保守性，但其属非折叠蛋白，结构松散，使得天然Tat作为HIV疫苗的候选抗原尚存在诱发抗体尤其是免疫保护性抗体滴度低的问题。因此，本研究根据天然HIV-1 Tat分子各功能区特点及其亲疏水性分析，对HIV-1 Tat蛋白进行结构改造，原核表达多种截短的Tat突变体蛋白及其与HCV核心蛋白(HCVC)高疏水区122-191aa融合的重组抗原;分别用全长Tat及Tat突变体蛋白制备金标体颗粒，免疫C57BL小鼠进行免疫原性分析;尝试用无细胞体外合成系统制备不同Tat突变体与HCVC122-191融合的重组抗原，并经透射电镜鉴定其颗粒性特征，实验结果将为进一步研究HIV-1Tat生物学功能及制备安全有效的Tat颗粒性免疫原奠定基础。
　　 本研究分以下三个部分:
　　 第一部分HIV-1 Tat突变体与HCV核心蛋白融合重组抗原的原核表达HIV-1 Tat蛋白可分为6个功能区:N端区(1-21aa)、半胱氨酸富集区(22-37aa)、核心区(38-47aa)、碱性氨基酸富集区(48-57aa)、谷氨酰胺富集区(58-72aa)以及C端区(73-101aa)）。在我们前期对Tat抗原结构改造及免疫原性分析的基础上，本研究结合对全长Tat蛋白亲疏水性分析结果，首先构建并原核表达了缺失Tat高疏水区(31-45aa)的HIV-1 HXB2株Tat突变体融合蛋白PET32a-Tat△(31-45)。基本方法和结果如下:以质粒pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)为模板，经PCR和Overlap PCR获得tat△(31-45)目的基因片段，构建其原核表达质粒pET32a-Tat△(31-45)，再将该重组表达质粒转入E.coli BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达，结果获得高表达的截短的Tat突变体融合蛋白PET32a-Tat△(31-45)，其相对分子量约为27，600，其表达量约占菌体总蛋白的55％，明显高于全长Tat和其他Tat突变体蛋白的原核表达量。此外，本研究还利用本实验室前期正确构建保存的不同HIV-1Tat重组表达质粒（pET32a-Tat1-101，pET32a-Tat22-86，pET32a-Tat-22-101, pPEPTIDE2-Tat1-21, pPEPTIDE2-Tat38-61和pPEPTIDE2-Tat60-101)，同上经原核表达，分别获得相对应的全长Tat及其突变体融合蛋白，作为本研究中对照及检测用蛋白;用Ni-NTA亲和层析法纯化上述目的融合蛋白。Western blot鉴定结果显示，PET32a-Tat1-101和PET32a-Tat△(31-45)融合蛋白均与小鼠抗TatN末端单克隆抗体呈特异性反应，而pET32a载体蛋白则无此反应。
　　 在此基础上，选择具有自我组装功能的HCV核心蛋白(HCVC)高疏水区122-191aa为载体，制备不同Tat突变体与HCVC122-191融合的重组抗原。方法是经PCR对编码HCVC122-191基因进行大肠杆菌喜爱密码子优化，以OverlapPCR将tat△(31-45)与HCVC(122-191) DNA片段拼接后，克隆至原核表达载体pPEPTIDE2中，构建原核重组表达质粒pPEPTIDE2-Tat△(31-45)-HCVC(122-191)。将该重组表达质粒及本室前期构建正确的2种Tat-HCVC重组质粒(pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)和pPEP-Tat22-86-HCVC(122-191))转入E.coli BL21(DE3)中，经常规IPTG诱导表达（37℃诱导3.5h），用12％ SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果未获得目的表达条带。随后用低温长时间IPTG诱导方法，即在30℃条件下，在表达菌株E.coliBL21(DE3)中，分别经IPTG诱导10 h表达3种Tat-HCVC重组原核表达质粒(pPEP-Tat△(31-45)-HCVC(122-191), pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)和pPEP-Tat22-86-HCVC(122-191))，表达产物经12％ SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果仍未观察到HIV-1 Tat-HCVC122-191重组蛋白表达条带，未获得预期实验结果。
　　 第二部分HIV-1 Tat及其突变体蛋白的金标体颗粒制备与免疫原性分析为解决第一部分中HIV-1 Tat-HCVC122-191融合重组抗原经原核系统表达未得到预期阳性结果的问题，本研究同时进行了Tat及其突变体金标体颗粒的制备（第二部分）以及用无细胞体外合成系统表达Tat-HCVC122-191融合颗粒性抗原（第三部分）。第二部分研究首先用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，经分光光度计和透射电镜检测鉴定，获得分散度和均一度均较好的两种金颗粒(平均颗粒大小分别约75.5 nm和32.5 nm)。将Tat及3种Tat突变体融合蛋白(PET32a-Tat△(31-45)、PET32a-Tat22-101和PET32a-Tat22-86）分别标记75.5nm胶体金颗粒，用NaC1聚沉实验检测在不同pH条件下Tat及其突变体蛋白金标体复合物的稳定性;分别用上述Tat蛋白及其金标体复合物免疫C57/BL小鼠，制备小鼠抗血清，经ELISA方法检测小鼠免疫抗血清抗体滴度以及与Tat不同肽段的反应性。
　　 实验结果表明，全长Tat1-101和Tat△(31-45)蛋白金标体溶液分别在pH5.5～9.5、pH5.5～11.0范围内较好地保持其稳定性，Tat22-101和Tat22-86蛋白金标体溶液分别在pH4.0～9.5、pH4.5—9.5较好地保持其稳定性。ELISA检测结果显示，所有实验组均能诱导产生抗全长Tat免疫抗血清，其中Tat1-101金标体组抗Tat小鼠抗血清滴度最高(1，024，000)，显著高于Tat1-101蛋白组和其他免疫组;当Tat△(31-45)标记胶体金后其诱导产生的抗Tat抗体滴度明显提高，表明胶体金标记对全长Tat和Tat△(31-45)突变体蛋白免疫原性的增强作用明显。
　　 表位分析结果显示，全长Tat1-101蛋白标记胶体金后的免疫反应增强作用，主要是诱导产生抗TatN端表位的抗体;抗Tat22-86蛋白和抗Tat22-86金标体两者小鼠抗血清与Tat38-61和Tat60-101的反应性达到抗全长Tat小鼠抗血清水平;抗Tat22-101金标体小鼠抗血清与Tat C末端60-101aa的反应性明显增强，明显高于抗全长Tat抗血清与Tat60-101的反应性;抗Tat△(31-45)金标体小鼠抗血清与Tat1-21、Tat38-61和Tat60-101三个肽段的结合作用均显著增强，也达到抗全长Tat或抗全长Tat金标体抗血清水平。上述结果表明，本研究制备的3种Tat突变体融合蛋白(Tat22-101、Tat22-86和Tat△(31-45))金标体颗粒均较好地保留了免疫原性，且可诱导产生针对Tat不同功能区表位的抗体，为联合应用Tat表位抗原制备新型HIV Tat疫苗奠定试验基础。
　　 第三部分HIV-1 Tat突变体与HCVC122-191融合颗粒性抗原的无细胞体外表达与鉴定该部分尝试用无细胞体外合成系统表达Tat及其突变体与HCVC122-191融合的颗粒性抗原。方法是用Overlap PCR将tat1-101、tat1-86、tat22-101、tat22-86和tat△(31-45)分别与HCVC122-191 DN△片段进行拼接，经NcoI和BamHI双酶切及序列测定正确后，分别克隆至大肠杆菌无细胞表达质粒pIVEX2.4d中，构建5种重组无细胞表达质粒(pIVEX2.4d-Tat1-101-HCVC122-191、pIVEX2.4d-Tat1-86HCVC122-191、 pIVEX2.4d-Tat22-101-HCVC122-191、pIVEX2.4d-Tat22-86-HCVC122-191和pIVEX2.4d-Tat△(31-45)-HCVC(122-191),用基于大肠杆菌细胞裂解液的无细胞蛋白合成系统进行融合蛋白的表达，经12％SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物，用透射电镜检测表达的HIV-1Tat-HCVC122-191重组蛋白的颗粒性特征。
　　 实验结果表明，2种Tat-HCVC重组蛋白（Tat22-100-HCVC122-191和Tat22-86-HCVC122-191）表达产物出现表达条带，分子量大小分别约16.10 kDa和14.35 kDa，与理论值相符。Western blot鉴定结果显示，Tat22-101-HCVC122-191和Tat22-86-HCVC122-191融合蛋白均与小鼠抗Tat单克隆抗体(Anti-HIV-1 Tatantibody(71-81))呈阳性特异性结合反应。负染法透射电镜检测结果表明，2种Tat-HCVC重组蛋白（Tat22-101-HCVC122-191和Tat22-86-HCVC122-191）均具有明显颗粒性特征，直径大小分别约175±30mm和188±39nm，而对照组蛋白（Tat22-86和Tat22-101）未见颗粒样结构，表明高疏水性HCVC122-191保持了良好的自组装功能，Tat突变体蛋白与之融合后可形成新型Tat颗粒性抗原。
　　 总结:
　　 1.成功构建缺失HIV-1 Tat高疏水区31-45aa的Tat突变体原核表达质粒，并获得高表达的Tat突变体重组蛋白PET32a-Tat△(31-45)，提示Tat高疏水区31-45aa对HIV-1 Tat及Tat突变体蛋白的表达有一定的抑制作用。
　　 2.经酶切鉴定和序列测定证实构建正确的3种Tat与HCV核心蛋白(HCVC)高疏水区（122-191aa）DNA序列重组的原核表达质粒(pPEPTIDE2-Tat△(31-45)-HCVC(122-191)、pPEP-Tat1-101-HCVC(122-191)和pPEP-Tat22-86-HCVC(122-191))转入E.coli BL21(DE3)菌株中，用常规IPTG诱导表达（37℃诱导3.5 h）和低温长时间IPTG诱导表达(30℃诱导10h)均未观察到目的表达条带，未获得预期实验结果。
　　 3.胶体金标记对全长Tat和Tat△(31-45)突变体蛋白免疫原性有明显增强作用;制备的3种Tat突变体融合蛋白(PET32a-Tat△(31-45)、PET32a-Tat22-101和PET32a-Tat22-86)金标体颗粒均保留了较好的免疫原性，其中抗Tat△(31-45)金标体小鼠抗血清与三个Tat肽段（Tat1-21、Tat38-61和Tat60-101）的结合作用均显著增强，达到抗全长Tat蛋白或抗全长Tat金标体小鼠抗血清水平;抗Tat22-86金标体小鼠抗血清与Tat38-61和Tat60-101的反应性也达到抗全长Tat小鼠抗血清水平;而抗Tat22-101金标体小鼠抗血清与Tat C末端60-101aa的反应性则明显高于抗全长Tat抗血清与Tat60-101的反应性，表明本研究制备的Tat突变体蛋白金标体颗粒可诱导产生较强的针对Tat不同功能区表位的抗体，有可能具有阻断天然Tat蛋白的反式转录激活等生物学活性的作用。
　　 4.构建5种HIV-1Tat-HCVC122-191重组无细胞表达质粒(pIVEX2.4d-Tat(1-101)-HCVC(122-191), pIVEX2.4d-Tat(1-86)-HCVC(122-191),pIVEX2.4d-Tat(22-101)-HCVC(122-191), pIVEX2.4d-Tat(22-86)-HCVC(122-191)和pIVEX2.4d-Tat△(31-45)-HCVC(122-191)，经无细胞合成系统表达，成功获得两种以HCVC122-191为疏水核心的纳米级新型Tat突变体颗粒性抗原(Tat(22-86)-HCVC(122-191)和Tat(22-101)-HCVC(122-191))，实验结果不仅为深入研究HIV-1 Tat生物学功能以及研发安全有效的基于Tat的HIV-1疫苗奠定基础，同时显示HCVC122-191有望作为一种有效载体也有可能为其他病原体颗粒性疫苗的研究提供新的途径。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

第一部分 HIV-1 Tat突变体与HCV核心蛋白融合重组抗原的原核表达

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第二部分 HIV-1 Tat及其突变体蛋白金标体颗粒的制备与免疫原性分析

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

第三部分 HIV-1 Tat突变体与HCVC122-191融合颗粒性抗原的无细胞体外表达及鉴定

一、材料与方法

二、实验结果

三、讨论

参考文献

综述

附录

致谢