HIV-1 tat基因改造及其蛋白表达、纯化与抗体制备

摘要

目的:为了方便实验室工作中HIV-1 B'/C亚型及C亚型Tat蛋白的检测,制备了相应的Tat蛋白及其抗体.方法:将我国HIV-1 B'/C亚型流行株tat基因的第1个外显子和HIV-1 C亚型tat基因的第2个外显子融合在一起,将密码子替换为大肠杆菌的优势密码子,通过合成引物、PCR拼接的方法,获得目的基因序列;在原核系统中与pET32a+载体中的His·Tag、Trx·Tag及S·Tag进行融合表达;目的蛋白经Ni+金属螯合层析柱纯化后,用于免疫家兔,制备多克隆抗体.结果:PCR拼接获得306 bp的目的基因序列;在原核系统中融合表达得到相对分子质量约31 000的融合蛋白,占菌体总蛋白的21%.纯化后的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,Western印迹结果显示,获得的多克隆抗体与HIV-1 B'/C亚型的Tat蛋白反应良好;间接免疫荧光结果表明,获得的多克隆抗体与HIV-1 B'/C亚型和C亚型的Tat蛋白都能产生特异性反应.结论:制备的多克隆抗体能够使用间接免疫荧光方法检测HIV-1 C亚型的Tat蛋白,使用Western印迹方法和间接免疫荧光方法都能检测HIV-1 B'/C亚型的Tat蛋白.