短链脂肪酸促进人和小鼠gastroids中产ghrelin细胞分化和小鼠胃排空的生理机制研究

摘要

Ghrelin是由胃粘膜中的内分泌细胞分泌而来，结构上与胃动素相似，是生长激素促分泌素受体的第一个内源性配体，由28个氨基酸组成，分子量3310，ghrelin有两种存在方式，即N端3位丝氨酸残基辛酰化和非酰化的ghrelin。它除了促进生长激素的释放、促进糖代谢、促进食欲、促进细胞增殖和抑制炎症因子释放外，还具有促进胃动力和加速胃排空的作用。但是，生理情况下血清中ghrelin只在长时间禁食后才会增加，并于进食后减少。因此它很难调节餐后的胃排空。
　　膳食纤维是包括可溶性纤维和不可溶性纤维的一种复杂的碳水化合物。不可溶性纤维有很多重要的特点，但可溶性纤维素可以在结肠经菌群酵解后产生大量的具有生理活性的产物，其中最主要的是短链脂肪酸，包括乙酸、丙酸和丁酸。它们在消化道有着非常重要的作用，包括给肠道上皮细胞提供能量和改变消化道的功能和结构。这些作用主要通过作用于GPR41和GPR43介导。Petersen等通过三维体外培养人和小鼠小肠organoid（器官球）的平台，发现短链脂肪酸可以选择性促进入和小鼠小肠organoid中L细胞的大量分化，从而促进大量GLP-1的分泌。
　　消化道上皮包含一个持续快速更新的系统，由肠道干细胞触发。这个系统可以很好的用来研究细胞的分化、增殖和迁移。最近，Sato和他的同事通过体外培养胃、小肠和结肠的上皮或者单独分离的干细胞进行体外培养，长成隐窝或腺体结构，这种结构可以持续产生组织来源的各种分化细胞。这些三维上皮结构起初命名为“organoid”，为了避免组织来源的混淆和由之前由隐窝和腺体周围的肌成纤维细胞组成的organoid的区别，我们把来源于胃的命名为gastroid，来源于小肠的命名为enteroid，来源于结肠的命名为colonoid。这种体外培养系统可以用来继续研究胃肠道干细胞的调节和消化道上皮细胞的增殖和分化。
　　由于胃排空延迟的疾病很常见，包括糖尿病性或者特发性胃轻瘫、功能性消化不良、手术后和肠内营养的患者。主要症状有胃饱胀感、腹痛、腹胀、早饱、恶心甚至呕吐。目前ghrelin已经被证明可以增加胃的三相收缩促进胃排空。因此，本研究利用gastroids三维体外培养系统，研究短链脂肪酸对产ghrelin内分泌细胞的影响和作用机制。与此同时，我们通过在体实验，研究高纤维素饮食和短链脂肪酸对胃和血液中ghrelin表达的影响，以及胃排空的影响。
　　本研究的主要研究结果如下:
　　一、离体实验
　　1、为了明确短链脂肪酸对产ghrelin内分泌细胞的分化的影响，我们通过该三维体外培养的gastroid系统研究短链脂肪酸对产ghrelin细胞分化的影响。我们通过3D体外培养技术培养小鼠和人的胃腺，获得具有胃干细胞特性的Gastroid，培养三周后，与乙酸(5mM)、丙酸(1mM)和丁酸(1mM)的混合物共培养24小时，对照组加正常培养基或者长链脂肪酸，结果发现短链脂肪酸混合物组与正常对照和长链脂肪酸处理组相比，ghrelin的基因表达增加了6-8倍。
　　2、短链脂肪酸分别在机体中存在两种受体GPR41和GPR43，为了进一步明确哪种受体起主要作用，我们利用GPR41和GPR43激动剂分别和gastroid共培养24小时，结果发现GPR43激动剂处理组与正常组相比，ghrelin基因表达增加了6-12倍左右。同时免疫荧光染色也发现GPR43激动剂处理组GPC的表达量与其他两组相比大量增加，同时90％的GPC表达GPR43。因此短链脂肪酸促进产ghrelin细胞分化的作用是通过GPR43介导的。
　　3、为了明确哪种短链脂肪酸起主要作用，我们分别利用三种短链脂肪酸各自和gastroid共培养，RT-PCR结果发现丁酸处理组小鼠gastroids的ghrelin基因表达增加了8.46倍，人gastroids的ghrelin基因表达增加了4.68倍。免疫荧光结果表明丁酸组GPC表达大量增加。因此丁酸是特异性促进产ghrelin内分泌细胞分化的短链脂肪酸。
　　4、为了进一步验证短链脂肪酸丁酸促进产Ghrelin细胞分化的独特作用，我们运用PCR技术检查了神经内分泌细胞标记物CGA，胃祖细胞标记物SOX9，胃表面粘液细胞标记物MUC5AC，胃腺细胞标记物TFF2，胃主细胞标记物MIST1和胃壁细胞标记物ATP4A的表达情况，结果发现丁酸只促进与产ghrelin内分泌细胞分化相关的CGA和SOX9表达增加，其他细胞标记物无明显改变。因此我们认为短链脂肪酸中丁酸可以特异性的通过GPR43受体促进人和小鼠gastroid中产ghrelin内分泌细胞的分化。
　　二、在体实验
　　1、通过体外实验我们明确了短链脂肪酸丁酸可以特异性的作用GPR43受体并促进产ghrelin细胞的分化。为了进一步明确这种作用，我们进行了体内实验。我们首先采用2周的高纤维饮食（果胶，30％）模型和高丁酸(丁酸，100mM)饮水模型检查短链脂肪酸对ghrelin表达的影响，western和PCR结果都表明二者都可以促进正常生理状态下胃中ghrelin的表达，ELISA方法也表明它们都可以增加生理状态下血清中活性ghrelin的含量。
　　2、与此同时，我们进行胃排空实验，将小鼠分为三组，正常组、高纤维饮食组和高丁酸饮水组。两周后，小鼠进食20小时后进行胃排空实验，结果发现高纤维素饮食组和高丁酸饮水组1小时胃排空量相较与正常组显著增加。因此我们认为高纤维饮食和高丁酸饮水都可以促进胃排空。
　　3、为了明确此作用是否是通过ghrelin表达所介导，我们用ghrelin拮抗剂处理高纤维饮食和高丁酸饮水组，结果发现它们的促胃排空作用可以被ghrelin拮抗剂阻断，因此我们认为高纤维饮食和高丁酸饮水的促胃排空作用是由增加ghrelin的表达所介导。
　　综上所述，短链脂肪酸丁酸可以特异性的作用于GPR43受体，促进gastroids中产ghrelin内分泌细胞的分化。高纤维饮食和短链脂肪酸丁酸也可以促进小鼠胃和血清中ghrelin的表达，加速胃排空，为胃动力障碍的患者提供了新的治疗思路。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一部分、小鼠gastroids的原代培养

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第二部分、人gastroids的原代培养

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第三部分、短链脂肪酸在小鼠gastroids中对产ghrelin内分泌细胞分化的影响和相关机制研究

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第四部分、短链脂肪酸在人gastroids中对产ghrelin内分泌细胞分化的影响和相关机制研究

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

第五部分、短链脂肪酸促进小鼠胃排空的生理机制研究

一、材料

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

参考文献

全文总结

综述

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