基因工程菌GS115-pPIC9k-ChiA4.0发酵生产HaSNPV几丁质酶的研究

摘要

几丁质酶(Chitinase)能够专一性的分解几丁质(Chitin)，作为生物杀虫剂具有对人畜无害的优点。棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(HaSNPV)是棉铃虫专一性病原微生物，通过分泌几丁质酶液化昆虫体壁，侵入体内抑制或杀死昆虫。本实验室近几年通过对HaSNPV几丁质酶基因重组、转化及表达的研究，旨在开发无毒无公害的生物杀虫剂。
　　 本研究的内容主要包括基因工程菌GS115-pPIC9k-ChiA4.0发酵生产HaSNPV几丁质酶的条件优化、扩大培养、分离纯化及几丁质酶的毒理学研究。
　　 在摇瓶水平上通过对发酵条件的单因素研究和诱导培养基主要成分配比的正交实验，发酵生产几丁质酶的最佳条件：以BMGY为培养基，pH6.0，30℃，250rpm，菌种培养16h～18h，离心重悬于诱导培养基(PEP2％、YNB1.34％、YE0.5％、甲醇1％、油酸0.05％)，pH6.0，29℃，每隔6h补加一次甲醇和甘油(20∶1)混合液，250rpm，诱导表达120h，发酵液中几丁质酶浓度达173.5U/mL。
　　 利用5L发酵罐对基因工程菌GS115-pPIC9k-ChiA4.0进行放大培养研究，结果表明：诱导前菌体浓度为60g/L左右，诱导阶段保持溶氧水平在20％～30％，甲醇-甘油交替补料，发酵液中几丁质酶浓度达372U/mL。将发酵液离心除菌后，其上清液经(NH4)2SO4盐析和离子交换层析分离纯化，几丁质酶浓度为2885.1U/mL，回收率为69.8％，经SDS-PAGE电泳分析表明已达电泳纯。
　　 对小菜蛾(Plutella xylostella)喷洒及喂食几丁质酶液，用透射电镜和扫描电镜观察处理后小菜蛾的表皮、中肠和围食膜细胞结构发现，HaSNPV几丁质酶通过分解细胞壁中的几丁质，引起细胞壁透性改变，渗透压加大，导致组织液化，虫体生长受阻或死亡。
　　 对6种常见植物病原真菌拮抗作用的实验表明，HaSNPV几丁质酶对番茄灰霉(Tomato botrytis cinerea)、小麦根腐病菌(Wheat common rot pathogen)、烟草赤星病菌(Tobacco brown spot pathogen)、番茄早疫菌(Tomato altemaria solani)和苹果炭疽菌(Colletitrichum gloeosporiodes)具有抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章综述

1.1几丁质概述

1.2几丁质酶简介

1.3杆状病毒几丁质酶

1.4 HaSNPV几丁质酶

1.5巴斯德毕赤酵母表达系统

1.6本研究的内容、目的及意义

1.7本研究的技术路线

第二章摇瓶水平发酵条件的优化

2.1实验材料

2.2发酵方法

2.3分析与检测方法

2.4发酵条件的优化策略

2.5结果与分析

2.6小结与讨论

第三章基因工程菌GS115-pPIC9k-ChiA 4.0的发酵罐培养研究

3.1实验材料

3.2实验方法

3.3结果与分析

3.4小结与讨论

第四章HaSNPV几丁质酶的分离纯化及毒理学研究

4.1实验材料

4.2几丁质酶的分离纯化方法

4.3 几丁质酶的毒理学研究方法

4.4结果与分析

4.5小结与讨论

结论与展望

参考文献

攻读硕士期间取得的学术成果

致谢