啤酒有害产酸细菌选择性培养基的优化

摘要

啤酒是以麦芽、水为主要原料，添加啤酒花，经啤酒酵母发酵而成的一种低酒精度、含有泡沫和一定量CO2的发酵酒。由于啤酒中存在乙醇(0.5‰-10％，w/v)，酒花苦味物质(大约17-55ppm的异α-酸)，高浓度的CO2(大约0.5％，w/v)，较低的pH值(3.8-4.7)，极低的氧含量(＜0.1ppm)，使得啤酒被认为是一种安全的饮料。但是如果操作不慎或卫生条件不严，仍难免有厌氧菌等有害菌的污染。乳酸菌是啤酒厂中最容易污染，且对啤酒质量危害最大的有害菌之一。 从济南、青岛、北京三地啤酒厂中分离到有害菌18株，经革兰氏染色、过氧化氢酶实验、发酵葡萄糖产乳酸实验等证明，15株为乳酸菌。从15株乳酸菌中选择6株典型的菌株，进行发酵麦汁产酸实验。结果表明，6株乳酸菌均能使麦汁酸度上升1.5°T。 啤酒有害乳酸菌按形态可分为乳酸杆菌和乳酸球菌。采用单因素实验和正交实验优化乳酸杆菌和乳酸球菌的选择性培养基的成分和培养条件。单因素实验确定最优碳源、氮源分别为葡萄糖、胰蛋白胨、大豆蛋白胨，正交实验优化了其用量为：葡萄糖4％、胰蛋白胨2％、大豆蛋白胨0.5％；选择MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、K2HPO4作为培养基的无机盐组分，正交实验优化三者的用量为MgSO4·7H2O0.02％，MnSO4·4H2O0.005％，K2HPO40.4％；对供试菌L1、L3、P1、P2的生长因子进行筛选，发现VB5和泛酸钙对4株菌的生长有不同程度的促进作用。选择胡萝卜汁、番茄汁、苹果汁作为乳酸杆菌的天然生长因子，选择酵母粉、豌豆汁作为乳酸球菌的天然生长因子。正交实验优化乳酸杆菌天然生长因子的添加量为胡萝卜汁3％，番茄汁25％，苹果汁3％；乳酸球菌生长因子的用量为酵母粉0.3％，豌豆汁5％。确定了培养基的初始pH值为6.0-6.2，培养温度为25℃。 啤酒生产中很多工序的取样中都存在啤酒酵母，啤酒酵母的存在干扰有害菌的检测。采用纳他霉素作为啤酒酵母的抑制剂。纳他霉素是一种新型抗真菌剂。采用圆滤纸片法测定了纳他霉素对供试酵母206＃、308＃、303＃、354＃的抑制效果。 实验表明，5ppm纳他霉素对四株菌产生的抑菌圈直径分别为14mm、16mm、16mm、18mm；最低抑制浓度实验表明，纳他霉素对206＃、303＃、354＃的MIC为3ppm，对308＃的MIC为4ppm。高温、强酸、强碱影响纳他霉素的抑菌活性。纳他霉素经121℃维持30min后，10ppm纳他霉素无法抑制供试菌株的生长。当pH在5.0-7.0时，纳他霉素抑菌活性最高；当pH＜5.0或＞7.0时，溶解度提高，但是活性损失增大。 乳酸菌在培养基中生长代谢，产生乳酸，改变培养基的pn值。单一指示剂存在变色pH范围过宽，或变色不够灵敏等缺点，因此优化了混合指示剂。将氯酚红与溴钾酚紫、溴钾酚绿、溴酚蓝、溴百里香酚蓝四种指示剂按照不同的比例混合组成混合指示剂，实验表明，以氯酚红与溴钾酚紫混合的效果最佳。用pH计测定溶液变色前后的pH值，结果表明，氯酚红与溴钾酚紫按1:3的比例混合时，颜色由紫红变为黄色，且变色pH范围为6.45-5.93，单因素实验确定其在培养基中的最佳添加量为1.0％(v/v)。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章绪论

1.1啤酒及啤酒工业的发展

1.2啤酒酿造原料

1.2.1水

1.2.2麦芽

1.2.3酒花

1.2.4啤酒酵母

1.3啤酒生产工艺

1.4啤酒有害菌

1.4.1啤酒有害菌定义

1.4.2有害菌的来源

1.4.3啤酒有害菌分类

1.4.4啤酒有害菌的危害

1.5检测方法

1.5.1平板菌落计数法(colony-counting method)

1.5.2PCR法

1.5.3 DNA杂交法

1.5.4免疫学方法

1.5.5色谱法

1.6立题依据及研究内容

1.6.1立题依据

1.6.2研究内容

第2章啤酒中有害乳酸菌的分离

2.1引言

2.2材料与方法

2.2.1样品

2.2.2主要试剂

2.2.3培养基

2.2.4实验方法

2.3结果与讨论

2.3.1有害菌的分离纯化

2.3.2啤酒有害菌的培养特征和形态特征

2.3.3乳酸定性测定实验

2.3.4啤酒有害乳酸菌生长曲线的测定

2.4小结

第3章啤酒有害乳酸菌培养基的优化设计

3.1引言

3.2材料与方法

3.2.1材料

3.2.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1最大吸收波长λmax的测定

3.3.2碳源单因素实验结果

3.3.3氮源单因素实验结果

3.3.4最适碳源、氮源正交实验优化

3.3.5无机盐正交实验优化

3.3.6生长因子的优化

3.3.7 pH值对供试菌株生长的影响

3.3.8培养温度对供试菌株生长的影响

3.4小结

第4章酵母抑制剂的选择

4.1引言

4.2材料与方法

4.2.1材料

4.2.2方法

4.3结果与讨论

4.3.1纳他霉素抑菌性能实验

4.3.2纳他霉素最低抑制浓度(MIC)实验

4.3.3纳他霉素对细菌生长的影响

4.3.4纳他霉素耐热性能实验

4.3.5酸碱度对纳他霉素抑菌作用的影响

4.4小结

第5章混合指示剂的研究

5.1引言

5.2材料与方法

5.2.1材料

5.2.2方法

5.3结果与讨论

5.3.1颜色变化的测定

5.3.2混合指示剂变色点的测定

5.3.3混合指示剂添加量的优化

5.4小结

结论

展望

附图

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文