壳低聚糖的酶法制备及其Cr配合物的研究

摘要

壳低聚糖是壳聚糖(chitosan)经水解后产生的一类低聚合度(n一般在2～20)可溶于水的氨基糖类化合物，其化学结构是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GLcNAc)和D-氨基葡萄糖(GLcN)通过β-1，4糖苷键连接起来的低聚糖。同壳聚糖大分子相比，壳低聚糖作为功能性低聚糖除了具有促进双歧杆菌的生长繁殖以外，还具有一些独特的功能性质。这些性质包括良好的水溶性、吸湿保湿性、抗菌抑菌性、抗肿瘤、降胆固醇和提高动植物的生理活性等。由于壳低聚糖所特有的各种生理活性和功能性质，使其在保健食品、生物医药、日用化妆品、医疗诊断和生物生理等方面具有独特的应用价值，因此其大规模生产将具有非常重要的经济价值。 本论文通过对硅胶G薄层—比色法检测壳低聚糖、单一酶和复合酶制备壳低聚糖、以及壳低聚糖Cr(Ⅲ)离子配合物制备等进行研究，建立了一种简便、高效、快速检测壳低聚糖含量的方法，提高了壳低聚糖的得率，并且为一种新型的降糖保健品的大规模工业化生产奠定了基础。 采用硅胶G薄层-DNS法检测壳低聚糖的含量，当展开剂为乙酸乙酯：无水乙醇：水：氨水=5:5:4:0.45、显色剂为苯胺—二苯胺—磷酸、点样量为2μg/μL时、可将壳低聚糖单糖至六糖各组分分开，斑点清晰、圆形、无拖尾，分离效果好。以硅胶G薄层—比色法检测壳低聚糖的含量，具有样品回收率高、相对误差较小、方法简便、准确性高等优点，适合于壳低聚糖常规检验。 以壳低聚糖的得率为指标，分别研究了不同因素对纤维素酶、果胶酶、β-葡聚糖酶制备壳低聚糖的影响，试验结果表明纤维素酶的最适反应条件为：温度55℃、pH4.4、底物浓度1.0％、酶用量1500U、反应时间2.5h。果胶酶的最适反应条件为：温度50℃、pH4.2、底物浓度1.0％、酶用量1500U、反应时间3.0h。β-葡聚糖酶的最适反应条件为：温度60℃、pH4.0、底物浓度1.0％、酶用量1000U、反应时间2.5h。 以壳低聚糖的得率为指标，分别研究了纤维素酶-果胶酶，纤维素酶—β-葡聚糖酶，果胶酶—β-葡聚糖酶复合制备壳低聚糖的影响因素，并进行了工艺优化，试验结果表明纤维素酶-果胶酶复合制备壳低聚糖的最优工艺条件为：酶的复合比例2:1、温度55℃、pH值4.4、底物浓度1.0％、酶用量2000U、反应时间2.0h，在此条件下壳低聚糖得率为35.34％。纤维素酶—β-葡聚糖酶复合制备壳低聚糖的最优工艺条件为：酶的复合比例1:2、温度60℃、pH值4.4、底物浓度1.5％、酶用量2000U、反应时间2h，在此条件下壳低聚糖得率为34.22％。果胶酶—β-葡聚糖酶复合制备壳低聚糖的最优工艺条件为：酶的复合比例1:1、温度50℃、pH值3.8、底物浓度1.5％、酶用量1500U、反应时间3.0h，在此条件下壳低聚糖得率为29.78％。 以壳低聚糖与铬(Ⅲ)离子配合物的得率为指标，研究反应pH值、温度、底物浓度、时间对结合率的影响，结果表明各因素对制备工艺的影响大小为：反应pH值＞反应时间＞反应温度＞底物浓度。并采用正交试验进行了工艺优化，最优工艺为反应pH8.5、反应时间3.5h、反应温度45℃、底物浓度为8％，在此条件下，壳低聚糖与Cr(Ⅲ)离子配合物结合率可达25.04％。对制备的配合物的结构进行了红外光谱、紫外-可见光谱分析，研究结果表明，壳低聚糖与铬(Ⅲ)离子能形成稳定的配合物，经红外、紫外光谱分析其配位的基团是-NH2基。

目录

文摘

英文文摘

声明

1前言

1.1绪论

1.2 甲壳素和壳聚糖

1.2.1 甲壳素

1.2.2壳聚糖

1.3壳低聚糖国内外研究进展

1.3.1壳低聚糖的组成、结构和性质

1.3.2壳低聚糖的生理功能

1.3.3壳低聚糖的制备方法

1.4壳低聚糖的检测

1.5壳低聚糖的应用

1.5.1在生物医药方面的应用

1.5.2在轻纺工业方面的应用

1.5.3在农业生产中的应用

1.5.4在保健食品中的应用

1.5.5在日用化妆品方面的应用

1.6壳低聚糖的化学修饰及其应用

1.6.1壳低聚糖的化学修饰

1.6.2壳低聚糖衍生物的应用

1.7选题的目的及意义

2壳低聚糖检测方法的研究

2.1试验材料与设备

2.1.1主要材料

2.1.2主要设备

2.2壳低聚糖薄层分析

2.2.1壳低聚糖标准溶液的制备

2.2.2薄层展开法鉴定壳低聚糖糖组分

2.3壳低聚糖薄层分析条件的选择

2.3.1展开剂的筛选

2.3.2显色剂的筛选

2.3.3点样对分离效果的影响

2.3.4上行距离对分离效果的影响

2.4壳低聚糖定量分析

2.4.1斑点面积法

2.4.2薄层-苯酚-硫酸法

2.4.3薄层-DNS法检测壳低聚糖含量

2.5结果与分析

2.5.1壳低聚糖薄层分析结果

2.5.2斑点面积法检测结果

2.5.3薄层-苯酚硫酸法检测结果

2.5.4薄层-DNS法检测结果

2.5.5小结

3单一酶法制备壳低聚糖

3.1材料与设备

3.1.1主要材料

3.1.2主要设备

3.2试验方法

3.2.1纤维素酶制备壳低聚糖工艺条件的研究

3.2.2果胶酶制备壳低聚糖工艺条件的研究

3.2.3 β-葡聚糖酶制备壳低聚糖工艺条件的研究

3.2.4壳聚糖酶解液中壳低聚糖的检测

3.3结果与分析

3.3.1纤维素酶制备壳低聚糖试验结果

3.3.2果胶酶制备壳低聚糖试验结果

3.3.3 β-葡聚糖酶制备壳低聚糖试验结果

3.3.4单一酶水解产物的分析结果

3.4小结

4复合酶法制备壳低聚糖工艺研究

4.1材料与设备

4.1.1主要材料

4.1.2主要设备

4.2试验方法

4.2.1纤维素酶-果胶酶制备壳低聚糖工艺条件的研究

4.2.2纤维素酶-β-葡聚糖酶制备壳低聚糖工艺条件的研究

4.2.3果胶酶-β-葡聚糖酶制备壳低聚糖工艺条件的研究

4.3结果与讨论

4.3.1纤维素酶-果胶酶制备壳低聚糖试验结果

4.3.2纤维素酶-β-葡聚糖酶制备壳低聚糖试验结果

4.3.3果胶酶-β-葡聚糖酶制备壳低聚糖试验结果

4.3.4复合酶水解产物的结果分析

4.4小结

5壳低聚糖Cr(Ⅲ)配合物制备工艺的研究

5.1材料与设备

5.1.1试验材料

5.1.2试验设备

5.2壳低聚糖铬配合物制备

5.2.1制备方法

5.2.2单因素试验

5.2.3正交试验

5.2.4壳低聚糖Cr(Ⅲ)配合物的结构表征

5.2.5壳低聚糖Cr(Ⅲ)配合物的检测

5.3结果与讨论

5.3.1单因素试验试验结果

5.3.2正交试验试验结果

5.3.3壳低聚糖Cr(Ⅲ)配合物的结构分析

5.4小结

6结论与展望

6.1结论

6.2展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文及出版的著作目录