一种甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法

摘要

本发明属于精细化工技术领域，具体涉及一种分子量在5万以下甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法。首先使甲壳质溶解在一定溶剂中并在酸催化下匀相降解得到一定分子量的甲壳质低聚糖，甲壳质低聚糖再经过强碱脱乙酰处理制备壳低聚糖和壳寡糖。甲壳质低聚糖经强碱脱乙酰处理后，得到脱乙酰度在50％至98％的壳低聚糖或壳寡糖。由于乙酰氨基葡萄糖间的糖苷键在酸催化条件下更易于被降解，甲壳质降解反应可以在温和的条件下进行，产率高，并有效实现对分子量的控制。本发明制备的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的分子量可以在1千至数万的范围内连续可调，分子量分布较窄，产品质量高，并显著降低了生产成本。

说明书

技术领域

本发明属于精细化工技术领域，具体涉及一种分子量在5万以下甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法。

背景技术

作为仅次于纤维素的第二大可再生资源，甲壳质广泛存在于海洋甲壳动物外壳、软体动物内骨骼、昆虫翅膀、菌类及藻类细胞壁内，蕴藏量巨大，尚未得到有效开发。壳聚糖为甲壳质脱乙酰化处理后的产物，是惟一大量存在的带正电荷碱性氨基天然多糖，生物相容性好，具有许多特殊的物理、化学和生理活性，被认为是“人体第六生命要素”。但由于壳聚糖是高分子化合物，相对分子质量通常在几十万至上百万，且分子结构紧密，不能溶于水等一些普通溶剂，在体内不易降解吸收，从而影响了它的应用范围。

壳低聚糖是壳聚糖在适当条件下降解到平均分子量小于一万时的产物。壳寡糖一般认为是壳聚糖进一步降解后形成的2～10个氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的壳低聚糖。同壳聚糖相比，壳低聚糖和壳寡糖具备水溶性好、生物活性高、功能作用大、易被人体吸收等特点和其它独特的功能，具有壳聚糖不可比拟的优越性。

研究表明，壳低聚糖或壳寡糖可通过动物肠道上皮细胞直接被吸收，人体吸收率可达到99.88％，表现出抑菌、抗肿瘤、调血脂、调节免疫及活化肠道双歧杆菌等多种生理功能。壳低聚糖或壳寡糖在酸性条件下游离氨基质子化，能够与细菌的细胞膜作用，干扰细菌细胞膜功能，抑制真菌和微生物的生长，表现出明显的抗菌抑菌作用。壳低聚糖或壳寡糖具有调控植物生长、发育、繁殖、防病抗病等方面的功能，能够刺激植物的免疫系统反应，激活防御反应，产生具有抗病害的活性物质，抑制病害的形成，诱导植物的抗病性，对多种真菌、细菌和病毒产生免疫和杀灭作用。壳低聚糖或壳寡糖产品已经在化学、医药、食品、化妆品、农业、环保、畜禽业等诸多方面得到了广泛应用。

目前，壳低聚糖或壳寡糖的制备途径主要是通过壳聚糖的酸降解(JPS6121103，KR100296738)、双氧水氧化降解(CN200410020831.1，CN201010172203.0，CN201110125040.5)和酶解(US4970150，CN200510019438.5，CN01126457.8，CN201010172203.0，CN200710051931.4)等技术路线。酸降解法操作简单，但降解条件较难控制，所用的水体积大、耗能大，降解产品中单糖和二糖含量高，水溶性寡糖产率低。氧化降解法利用双氧水在水溶液中电离形成的各种具有极强氧化性的游离基团攻击壳聚糖上的糖苷键，反应剧烈，降解速度较快，寡糖结构易于被破坏，得到的壳寡糖产品质量不易控制。酶解法用水解酶对壳聚糖进行生物降解，反应条件温和，能耗低，副反应少，是目前国内外研究的重点。但酶解法工序复杂、降解效率低，时间长，投资大。目前所用的酶活性不高，提纯难度大，专一性不强，造成产品收率低，生产成本高。

分子量大小对壳低聚糖的许多物理性质均有很大影响，如：分子量越小，壳低聚糖的溶解性、流变性和通透性越好，液晶性和成膜性越差。研究表明壳低聚糖的抑菌能力随着平均分子量的降低而逐渐增强，在分子量为1500时抑菌效果最好；而较高分子量的壳低聚糖对降低肝总脂肪含量和降低胆固醇的活性更高；当壳寡糖的聚合度为6时具有最好的抗癌、抑癌等活性。因此，控制壳低聚糖和壳寡糖的分子量对系统研究壳低聚糖和壳寡糖的生物活性，提升相关产品品质，控制产品质量具有重要的意义。而现有的壳低聚糖和壳寡糖工业化制备技术还很难对分子量进行有效的控制。

Varum等研究表明在酸催化下，乙酰氨基葡萄糖间糖苷键的降解速率是氨基葡萄糖间糖苷键降解速率的100至1000倍(Carbohydr.Polym.46,89(2001))。在同等条件下，甲壳质的降解速度要远高于壳聚糖，因此甲壳质的降解可以在更温和的条件下进行。但由于分子内和分子间具有强氢键相互作用，甲壳质形成致密的晶体结构，不溶于水、稀酸、稀碱和一般的有机溶剂。在异相反应条件下，经强酸和加热作用甲壳质会完全降解成乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖，无法实现对降解产物分子量的控制。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，制备的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的分子量可以在1千至数万的范围内连续可调，分子量分布较窄。

本发明提供的技术方案是：

一种甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，首先使甲壳质在溶剂中溶解，在酸催化下匀相降解得到甲壳质低聚糖，甲壳质低聚糖再经过强碱脱乙酰处理制备壳低聚糖和壳寡糖。

所述的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，具体步骤如下：

1)甲壳质用粉碎机粉碎后分散于溶剂中，在强力搅拌下，甲壳质在溶剂中充分溶胀或溶解；

2)甲壳质开始降解，分子量逐步降低，经过分离、纯化、干燥过程，得到甲壳质低聚糖；

3)甲壳质低聚糖加入到强碱溶液中进行脱乙酰反应，经过分离、纯化、干燥过程，得到壳低聚糖和壳寡糖产品。

所述的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，甲壳质经漂洗烘干后，再采用粉碎机粉碎至80～200目。

所述的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，溶解甲壳质的溶剂为六氟异丙醇、六氟丙酮、二氯乙醇、含有氯化锂的二甲基甲酰胺、含有氯化锂的二甲基乙酰胺、N-甲基氧化吗啉、浓盐酸、浓硫酸、浓磷酸、甲基磺酸、甲酸、二氯乙酸、三氯乙酸中的一种或两种以上的混合物，溶剂用量为甲壳质质量的5～50倍。

所述的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，当采用弱酸性溶剂：六氟异丙醇、六氟丙酮、二氯乙醇、含有氯化锂的二甲基甲酰胺、含有氯化锂的二甲基乙酰胺、N-甲基氧化吗啉、甲酸、二氯乙酸、三氯乙酸的一种或两种以上时，通过加入盐酸或硫酸，以提高甲壳质的降解速度。

所述的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，弱酸性溶剂中加入的盐酸或硫酸质量为溶剂质量的0.2～12％。

所述的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，甲壳质低聚糖的分离、纯化、干燥过程，采用溶剂蒸发、醇沉、柱层析、膜分离技术进行分离纯化，并经过真空干燥、喷雾干燥或鼓风干燥，得到甲壳质低聚糖产品；甲壳质低聚糖脱乙酰反应后的分离、纯化、干燥过程，采用醇沉、柱层析、膜分离技术进行分离纯化，并经过真空干燥、喷雾干燥或鼓风干燥，得到壳低聚糖和壳寡糖产品。

所述的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，醇沉法采用的醇沉试剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、异戊醇、丙酮、丁酮中的一种或两种以上。

所述的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，甲壳质低聚糖脱乙酰基是在强碱溶液中进行，脱乙酰过程反应温度为40～140℃，反应时间1～20小时；强碱溶液采用10～60wt％的NaOH溶液或10～60wt％的KOH溶液，强碱溶液用量为甲壳质低聚糖质量的5～20倍。

所述的甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，甲壳质低聚糖经强碱脱乙酰处理后，得到脱乙酰度在50％至98％的壳低聚糖或壳寡糖；通过控制降解时间得到不同分子量的甲壳质低聚糖，在脱乙酰后，当分子量在高于3000时得到的是壳低聚糖，当分子量在3000以下时得到的是壳寡糖。

本发明的设计思想是：

本发明首先利用浓强酸、强极性溶剂、氟化溶剂或酰胺/氯化锂溶剂等溶解甲壳质，溶解后的甲壳质在酸催化条件下降解成甲壳质低聚糖，甲壳质低聚糖再经强碱脱乙酰过程制备出壳低聚糖和壳寡糖。经过半个多世纪的研究，已经发现了多种可以溶解甲壳质的溶液体系，包括高浓度的盐酸、硝酸、硫酸、磷酸等强酸，三氯乙酸、二氯乙酸、甲酸、甲基磺酸、氯代醇等强极性溶剂，酰胺/氯化锂体系，氟化溶剂等。本发明利用可以溶解甲壳质的溶剂，使甲壳质在溶解后的匀相条件下降解。由于乙酰氨基葡萄糖间的糖苷键在酸催化条件下，更易于被降解，甲壳质降解反应可以在温和的条件下进行，同时能够实现对分子量的有效控制。

本发明的优点及有益效果是：

1、改变常规的甲壳质先脱乙酰再降解成壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，本发明采用首先使甲壳质降解成甲壳质低聚糖再脱乙酰的技术路线，显著降低了生产成本。

2、同壳聚糖相比，甲壳质可以在更温和的条件下进行降解，反应过程易于控制，副产物少，产率更高。

3、甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的分子量可以在1千至数万的范围内连续可调，分子量分布较窄，产品质量高，性能易于控制。

附图说明

图1为壳低聚糖和壳寡糖的GPC凝胶色谱。

具体实施方式

在具体实施方式中，本发明甲壳质低聚糖、壳低聚糖和壳寡糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)用粉碎机将片状甲壳质粉碎至适当粒度，一般约(80～200目)。

(2)甲壳质颗粒分散于5倍至50倍溶剂中，在强力搅拌下，甲壳质在溶剂中充分溶胀或溶解。

(3)反应物在0℃～100℃保温1至10小时，甲壳质开始降解，分子量逐步降低，得到甲壳质低聚糖，通过控制反应时间可以得到不同分子量的甲壳质低聚糖。

(4)采用真空减压蒸发溶剂、醇沉、柱层析、膜分离等方法除去反应液体溶剂并纯化反应得到的甲壳质低聚糖。

(5)甲壳质低聚糖加入5至50倍体积的强碱溶液，加热至40℃至140℃并保温1至20小时进行脱乙酰反应。

(6)强碱脱乙酰后利用柱层析、膜分离或醇沉等方法除碱并进一步纯化，再经过鼓风干燥、喷雾干燥或真空干燥等干燥方法，得到脱乙酰度在50％至98％的壳低聚糖和壳寡糖。在脱乙酰过程中，多糖的分子量变化不大，通过控制降解时间得到不同分子量的甲壳质低聚糖。在脱乙酰后，当分子量在高于3000时得到的是壳低聚糖，当分子量在3000以下时得到的是壳寡糖。

为了使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

实施例1

在10℃下，10g甲壳质缓慢加入到200mL浓盐酸(36wt％)中。搅拌6小时后，甲壳质完全溶解。提高反应温度至30℃，搅拌1小时，而后向反应液中缓慢加入NaOH固体粉末中和反应溶液。反应溶液加入1000mL乙醇进行醇沉，析出的固体沉淀经过滤，乙醇清洗，鼓风干燥得到8克甲壳质低聚糖。

8克甲壳质低聚糖加入到160g的50wt％NaOH溶液中。反应温度90℃保温6小时。反应结束后，加入800mL乙醇进行醇沉。析出的固体沉淀经过滤，乙醇清洗，冷冻干燥得到6g的白色壳低聚糖粉末。壳低聚糖的分子量为11000，脱乙酰度为92％。

实施例2

在10℃下，10g甲壳质缓慢加入到200mL浓盐酸(36wt％)中。搅拌6小时后，甲壳质完全溶解。提高反应温度至30℃，搅拌1.5小时，而后向反应液中缓慢加入NaOH固体粉末中和反应溶液。反应溶液加入1000mL乙醇进行醇沉，析出的固体沉淀经过滤，乙醇清洗，鼓风干燥得到7.5克甲壳质低聚糖。

7.5克甲壳质低聚糖加入到160g的50wt％NaOH溶液中。反应温度90℃保温6小时。反应结束后，加入800mL乙醇进行醇沉。析出的固体沉淀经过滤，乙醇清洗，冷冻干燥得到5.8g的白色壳低聚糖粉末。壳低聚糖的分子量为5000，脱乙酰度为93％。

实施例3

在10℃下，10g甲壳质缓慢加入到200mL浓盐酸(36wt％)中。搅拌6小时后，甲壳质完全溶解。提高反应温度至30℃，搅拌2小时，而后向反应液中缓慢加入NaOH固体粉末中和反应溶液。反应溶液加入1000mL乙醇进行醇沉，析出的固体沉淀经过滤，乙醇清洗，鼓风干燥得到6.8克甲壳质低聚糖。

6.8克甲壳质低聚糖加入到160g的45wt％NaOH溶液中。反应温度80℃保温4小时。反应结束后，加入800mL乙醇进行醇沉。析出的固体沉淀经过滤，乙醇清洗，冷冻干燥得到4.9g的淡黄色壳寡糖粉末。壳寡糖的分子量为2500，脱乙酰度为90％。

实施例4

在30℃下，10g甲壳质缓慢加入到500mL六氟异丙醇中。搅拌6小时，甲壳质完全溶解后加入25mL浓盐酸。提高反应温度至50℃，搅拌1小时后，在50℃真空旋蒸，使绝大部分反应溶剂蒸发回收。反应产物加入乙醇清洗，过滤，鼓风干燥得到8.5克甲壳质低聚糖。

8.5克甲壳质低聚糖加入到160g的40wt％NaOH溶液中。反应温度80℃保温4小时。反应结束后，加入800mL乙醇进行醇沉。析出的固体沉淀经过滤，乙醇清洗，冷冻干燥得到5.4g的淡黄色壳寡糖粉末。壳寡糖的分子量为3000，脱乙酰度为86％。

实施例5

在20℃下，10g甲壳质缓慢加入到300mL甲酸。搅拌6小时，甲壳质完全溶解后加入21mL浓盐酸。提高反应温度至64℃，搅拌1小时后，在50℃真空旋蒸，使绝大部分反应溶剂蒸发回收。反应产物加入乙醇清洗，过滤，鼓风干燥得到7.6克甲壳质低聚糖。

7.6克甲壳质低聚糖加入到160g的40wt％NaOH溶液中。反应温度80℃保温4小时。反应结束后，加入800mL乙醇进行醇沉。析出的固体沉淀经过滤，乙醇清洗，冷冻干燥得到4.5g的黄色壳寡糖粉末。壳寡糖的分子量为1800，脱乙酰度为83％。

实施例6

在20℃下，10g甲壳质缓慢加入到300mL二氯乙酸。搅拌6小时，甲壳质完全溶解后加入5mL浓盐酸。提高反应温度至70℃，搅拌1.5小时后，在60℃真空旋蒸，使绝大部分反应溶剂蒸发回收。反应产物加入乙醇清洗，过滤，鼓风干燥得到7.0克甲壳质低聚糖。

7.0克甲壳质低聚糖加入到160g的40wt％NaOH溶液中。反应温度80℃保温4小时。反应结束后，加入800mL乙醇进行醇沉。析出的固体沉淀经过滤，乙醇清洗，冷冻干燥得到4.1g的黄色壳寡糖粉末。壳寡糖的分子量为2100，脱乙酰度为84％。

实施例结果表明，本发明首先使甲壳质溶解在一定溶剂中并在酸催化下匀相降解得到一定分子量的甲壳质低聚糖，甲壳质低聚糖再经过强碱脱乙酰处理制备壳低聚糖和壳寡糖。由于乙酰氨基葡萄糖间的糖苷键在酸催化条件下更易于被降解，甲壳质降解反应可以在温和的条件下进行，产率高，并有效实现对分子量的控制。如图1所示，从GPC凝胶色谱显示，本发明制备的壳低聚糖和壳寡糖的分子量可以在1千至4万的范围内连续可调，分子量分布较窄。