酸羊奶发酵菌株培养及冻干保护剂的研究

摘要

酸羊奶具有良好的保健功能和丰富的营养价值，引起研究者的关注和消费者的喜爱。本研究以制备酸羊奶直投式发酵剂的冻干菌粉为主旨。以本实验室前期从商业牛乳直投式发酵剂中分离出的适合羊奶发酵的保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus，LB）和嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus，ST)为试验菌株，就培养基的优化和冻干保护剂的筛选两方面，通过单因素试验、Plackett-Burman试验、爬坡试验、Box-Behnken试验设计及响应面优化法，对菌体活菌数和冻干存活率的影响进行研究，从而确定出最佳培养基组成及复合冻干保护剂配方。主要的研究结果如下。
　　 1.Plackett-Burman试验设计分别筛选了LB基础培养基中碳源/益生元、氮源、氨基酸类主要影响因子，结果表明酪蛋白水解物、谷氨酸和葡萄糖为主要影响因子。再通过爬坡试验、Box-Behnken试验设计及响应面优化，得到LB的最佳培养基为0.95％葡萄糖、1.55％酪蛋白水解物、0.0007％谷氨酸，0.59％K2HPO4，pH6.5。经验证，活菌数达到(2.95±0.07)×109cfu/ml，与预测值相近。
　　 2.Plackett-Burman试验设计分别筛选了ST基础培养基中碳源/益生元、氮源、氨基酸类主要影响因子，结果表明大豆蛋白胨、谷氨酸和酪蛋白水解物为主要影响因子。然后通过爬坡试验、Box-Behnken试验设计及响应面优化，获得ST的最佳培养基为1％葡萄糖，3％大豆蛋白胨、1％酪蛋白水解物、0.0015mg/L谷氨酸、0.2％KH2PO4，10％番茄汁，0.05％吐温-80，pH6.8。经验证，活菌数达到(1.91±0.07)×109cfu/ml，与预测值相近。
　　 3.测定了LB和ST在优化前和优化后菌体的生长曲线。LB在优化前后经20h培养活菌数由2.04×109cfu/ml增加到2.76×109cfu/ml，提高了1.35倍。且ST在优化前经12h培养活菌数为1.61×109cfu/ml，而在优化后10h培养达到1.95×109cfu/ml，提高了约1.2倍，且稳定期提前。表明用响应面法优化LB和ST的培养基是可行的。
　　 4.真空冷冻干燥获得两菌体的冻干菌粉。通过单因素试验、Plackett-Burman试验设计和响应面优化实验，从十种单一保护剂蔗糖、乳糖、脱脂乳、碳酸氢钠、谷氨酸钠、硫酸镁、抗坏血酸钠、酵母粉、维生素B2、磷酸缓冲液中，筛选出对LB冻干保护效果影响显著的因子。结果表明28％脱脂乳粉、24％乳糖、4.8％谷氨酸复合添加时对LB的冻干保护效果较好。经验证，该保护剂可使其存活率达(64.41±0.02)％，菌粉的活菌数为(3.22±0.02)×1011cfu/g，与预测值接近。
　　 5.Plackett-Burman试验设计分别筛选了ST糖类、益生元/醇类、蛋白/氨基酸类保护剂的主要影响因子，结果发现可溶性淀粉、Vc和蔗糖为主要影响因子。最后通过爬坡试验和Box-Behnken试验设计及响应面优化，获得了ST的最佳冻干保护剂配方为17％蔗糖、17％可溶性淀粉、0.4％Vc。经验证，该保护剂可使其存活率达到(69.93±0.07)％，菌粉活菌数达到(2.79±0.03)×1011cfu/g，与预测值接近。上述保护剂均以菌泥的等体积添加，并用磷酸缓冲液补充。
　　 本研究得到的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌培养基，能有效提高其发酵液中的活菌数，为菌体的进一步浓缩培养奠定了基础。同时复合冻干保护剂的添加，提高了菌体的冻干存活率。这不仅为酸羊乳产品的开发提供高活性的浓缩直投式发酵剂。也对利用山羊奶资源，推动奶山羊业的发展有重大意义。

目录

摘要

1 文献综述

1．1 羊奶概述

1．1．1 营养价值

1．1．2 国际羊奶市场现状

1．1．3 国内羊奶市场现状

1．1．4 羊奶与牛奶的比较

1．2 酸羊奶

1．3 酸奶发酵剂

1．3．1 酸奶的发展史

1．3．2 酸奶发酵剂的种类及特点

1．3．3 酸奶发酵剂的发展史及应用现状

1．4 酸奶发酵菌株培养及直投式发酵剂的国内外研究进展

1．4．1 菌体增殖培养基的国内外研究进展

1．4．2 保护剂的国内外研究进展

1．5 本课题目的意义和主要研究内容

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌种

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．1．4 溶液及培养基配制

2．2 技术路线及实验方法

2．2．1 技术路线

2．2．2 菌种活化及培养方法

2．2．3 保加利亚乳杆菌培养基优化

2．2．4 嗜热链球菌培养基优化研究

2．2．5 菌种生长曲线的测定

2．2．6 保加利亚乳杆菌复合保护剂的筛选

2．2．7 嗜热链球菌复合保护剂的筛选

2．3 分析检测方法

2．3．1 菌体浓度测定

2．3．2 pH值的测定

2．3．3 冻干存活率和单位菌粉活菌数的测定

3 结果与讨论

3．1 保加利亚乳杆菌培养基优化

3．1．1 碳源/益生元影响因子的筛选

3．1．2 氮源影响因子的筛选及效果分析

3．1．3 氨基酸类影响因子的筛选及效果

3．1．4 培养基影响因子综合筛选及优化

3．1．5 爬坡试验及结果分析

3．1．6 Box-Behnken试验设计及响应分析

3．2 嗜热链球菌培养基优化

3．2．1 碳源/益生元影响因子的筛选及效果

3．2．2 氮源影响因子的筛选及效果分析

3．2．3 氨基酸类影响因子的筛选及显著性

3．2．4 培养基影响因子综合筛选促进嗜热链球菌生长的效果

3．2．5 爬坡试验及结果分析

3．2．6 Box-Behnken试验设计及响应分析

3．3 保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生长曲线的测定

3．4 保加利亚乳杆菌复合冻干保护剂的筛选

3．4．1 单个冻干保护剂对乳杆菌的冻干效果分析

3．4．2 复合冻干保护剂的筛选及效果

3．4．3 爬坡试验及结果分析

3．4．4 Box-Behnken试验设计及响应分析

3．5 嗜热链球菌复合冻干保护剂的筛选

3．5．1 糖类保护剂影响因子的筛选及效果

3．5．2 益生元/醇类保护剂影响因子的筛选

3．5．3 蛋白／氨基酸类保护剂影响因子的筛选及显著性

3．5．4 嗜热链球菌复合冻干保护剂显著因子的筛选及效果

3．5．5 爬坡试验及结果分析

3．5．6 Box-Behnken试验设计及响应分析

4．结论、创新点和展望

4．1 结论

4．2 创新点

4．3 展望

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的成果

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