复合酶水解脱脂乳制备ACE抑制肽的研究

摘要

高血压是危害人类健康的主要疾病。研究发现，食源性降血压肽，与传统的降血压药物相比，安全性高、无毒副作用。乳及乳制品中不仅含有人体所需的营养物质，还含有多种生物活性肽。采用酶解脱脂乳制备具有调节高血压功效的ACE抑制肽，进而开发功能性乳制品，提高乳品的附加值，为预防高血压提供食疗方式。
　　本课题以脱脂牛、羊乳为原料，选用8种蛋白酶分别水解脱脂乳，筛选用于制备ACE抑制肽的最适酶；混料试验设计确定最佳酶配比，单因素及响应面法优化酶解工艺；超滤、大孔树脂、凝胶色谱、反相高效液相色谱法等分离纯化酶解液获得ACE抑制肽单一组分；测定脱脂牛、羊乳酶解液纯化后各组分氨基酸组成及肽分子量；比较酶解脱脂牛、羊乳的产肽率、肽回收率及ACE抑制率的差异性，得到如下研究结果：
　　（1）选用的8种蛋白酶中，碱性蛋白酶、地衣芽孢杆菌蛋白酶和Alcalase酶水解脱脂牛、羊乳的ACE抑制率明显高于其他5种。混料试验设计确定酶解脱脂牛乳复合酶的最佳配比为：EAlcalase酶：E地衣芽孢杆菌蛋白酶=0.566：0.434，此条件下水解度为60.29±0.28％，ACE抑制率为84.86±0.33%；酶解脱脂羊乳复合酶的最佳配比为：EAlcalase酶：E地衣芽孢杆菌蛋白酶：E碱性蛋白酶=0.388：0.406：0.206，该条件下，水解度为64.56±0.21%，ACE抑制率为82.54±0.18%。
　　（2）单因素和响应面法优化酶解脱脂乳工艺。酶解脱脂牛乳的最佳条件为：pH9.01、酶添加量（E/S）6.50%、温度61.80℃、水解时间50min，该条件下，水解度和ACE抑制率分别为61.12±0.38%和85.02±0.22%；酶解脱脂羊乳的最佳条件为：pH8.49、酶添加量（E/S）8.04、温度61.54℃、酶解时间90min，该条件下，水解度和ACE抑制率分别为65.39±0.01%和84.65±0.03%。
　　（3）脱脂牛、羊乳酶解液经超滤、大孔树脂DA201-C分离纯化后，其ACE抑制率分别达到91.90±0.36%和92.07±0.06%，IC50分别为：0.258±0.007mg/mL和0.253±0.011mg/mL。
　　（4）采用Sephadex G-25纯化上述大孔树脂DA201-C洗脱液，分别得到脱脂牛、羊乳酶解液三个组分，其中脱脂牛乳酶解液的三个组分中G2的IC50最小为0.175±0.003mg/mL，ACE抑制率为92.23±0.13%；脱脂羊乳酶解液的三个组分中F2的IC50最小为0.154±0.006mg/mL，相应ACE抑制率为93.88±0.33%。Sephadex G-15持续纯化组分G2、F2，各得到两个峰分别是G2-1、G2-2；F2-1、F2-2。组分G2-2、F2-2的ACE抑制活性较高，其ACE抑制率分别为92.54±0.22%和93.97±0.15%，相应IC50值分别为0.167±0.007mg/mL，0.121±0.004mg/mL。
　　（5）组分G2-2中的疏水性氨基酸、脂肪氨基酸和芳香族氨基酸含量分别占总氨基酸含量的76.59%、40.05%、31.86%；组分F2-2中相应氨基酸所占百分比为：73.17%、33.86%、33.72%。疏水性氨基酸和芳香族氨基酸是ACE抑制肽的主要活性组分，组分G2-2和F2-2的疏水性氨基酸和芳香族氨基酸分别高于G2-1、F2-1。脱脂羊乳酶解液分离纯化得到的组分F2-2，较脱脂牛乳酶解液纯化组分G2-2具有更高的ACE抑制活性，前者IC50为0.121±0.004mg/mL，较G2-2的IC50小0.046mg/mL。通过反相高效液相色谱进一步分离各组分，并采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定其ACE抑制肽序列，脱脂牛乳酶解液的G2-1、G2-2组分中分离鉴定出了10和8种肽，肽主要来源于β酪蛋白和ɑS1酪蛋白；脱脂羊乳酶解液的F2-2组分中分离鉴定出了11种肽，肽主要来自β酪蛋白、ɑS1酪蛋白和ɑS2酪蛋白。
　　本研究采用复合酶解脱脂乳制备高活性ACE抑制肽，比较酶解脱脂牛、羊乳ACE抑制肽组成及活性差异，为后续调节高血压功能性乳制品开发提供理论依据和技术参考。

目录

1 前言

1.1血管紧张素转换酶与高血压

1.2 乳源性ACE抑制肽研究现状

1.3 ACE抑制肽的制备及分离纯化方法

1.3.1 ACE抑制肽制备方法

1.3.2 分离纯化研究进展

1.4降血压肽的分析鉴定

1.5 ACE抑制肽结构及功能的研究现状

1.6 立题意义及研究内容

2材料与方法

2.1材料

2.1.1 试验材料与试剂

2.1.2 仪器设备

2.2 酶解脱脂乳技术路线与试验方法

2.2.1 技术路线

2.2.2 酶制剂的筛选

2.2.3 最佳酶配比的确定

2.2.4 复合酶解脱脂乳制备ACE抑制肽工艺优化

2.2.6 大孔树脂DA201-C脱盐

2.2.7 凝胶色谱Sephadex G-25和Sephadex G-15分离纯化

2.2.8 RP-HPLC分析ACE抑制肽的组成

2.3 分析测定方法

2.3.1 pH-Stat法测蛋白质水解度

2.3.2 ACE抑制活性的测定[78-79]

2.3.3 半抑制浓度IC50的测定

2.3.4 双缩脲法测定多肽含量

2.3.5氨基酸组成及序列鉴定

2.4 数据处理

3 结果与讨论

3.1 酶解脱脂乳制备ACE抑制肽适宜酶制剂的确定

3.2混料试验设计优化复合蛋白酶的组成

3.2.1复合酶配比对脱脂牛乳水解度影响结果分析

3.2.2复合酶配比对脱脂牛乳制备ACE抑制肽活性的影响分析

3.2.3 酶解脱脂牛乳复合蛋白酶的最佳配比

3.2.4复合蛋白酶配比对脱脂羊乳水解度影响分析

3.2.5复合酶配比对水解脱脂羊乳制备ACE抑制肽活性的影响

3.2.6酶解脱脂羊乳复合蛋白酶的最佳配比确定

3.3单因素试验优化复合酶解脱脂乳制备ACE抑制肽工艺

3.3.1温度影响复合蛋白酶水解脱脂乳制备ACE抑制肽的效果

3.3.2 pH对复合酶解脱脂乳产ACE抑制肽的效果分析

3.3.3 水解时间影响ACE抑制活性和水解度变化分析

3.3.4 酶添加量对ACE抑制活性和水解度影响分析

3.4 响应面优化复合酶解脱脂乳制备ACE抑制肽工艺条件

3.4.1 Box-Behnken设计优化脱脂牛乳复合酶解工艺

3.4.2 响应面优化复合酶水解脱脂羊乳工艺

3.5 ACE抑制肽分离纯化

3.5.1多肽标准曲线

3.5.2 脱脂乳酶解液超滤

3.5.3大孔树脂DA201-C脱盐精制

3.5.4凝胶色谱Sephadex G-25 分离纯化ACE抑制肽

3.5.5 凝胶色谱Sephadex G-15分离纯化ACE抑制肽

3.5.6 反相高效液相色谱法分析ACE抑制肽

3.6 酶法制备ACE抑制肽的结构鉴定

3.6.1氨基酸组成分析

3.6.2 ACE抑制肽分子量分布

3.6.3 ACE抑制肽结构鉴定

4 结论、创新点及展望

4.1 结论

4.2 创新点

4.3 展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的成果

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