大鼠癌钙调蛋白_OM基因克隆、原核表达载体构建及蛋白表达的实验研究

摘要

视觉神经中成熟的神经纤维和中枢神经系统（centralnervoussystem,CNS）的其他组成部分一样，一旦受损将非常难以修复。成熟的视网膜神经节细胞（retinalganglioncell,RGC）经历了损伤或视神经眶内损伤而发生凋亡后，无法再生。因此，如何延缓RGC的变性，并重新激活轴突再生程序，使它们能够幸存下来并在受损的视神经中再生出长长的的轴突一直是眼科及CNS研究领域关注的重点。近年来研究发现，眼内活化的巨噬细胞对RGC具有显著的促进轴突再生效应。而其中，由活化的巨噬细胞表达和分泌的癌钙调蛋白（oncomodulin,OM）是这一效应的最重要的介导者。进一步研究发现，在活体内，OM对损伤的成熟视神经及周围感觉神经元也有促进轴突再生作用。而OM发挥再生促进效应的确切机制尚不清楚。目前，国内外均尚未有报道。对于OM的结构和神经再生功能方面的研究，目前国内尚无报道。因此,对其进行相关研究,可为神经再生新途径的研究提供一定的实验依据。本实验通过RT-PCR从活化的大鼠巨噬细胞中获得OM基因，构建了pET22b(+)-OM原核表达载体并成功表达了OM，为进一步完成对该蛋白的纯化及对其活性研究与探讨其促进轴突再生的作用机制奠定基础。
　　目的：
　　1.对大鼠癌钙调蛋白（OM）进行基因克隆，构建原核表达质粒并加以鉴定。
　　2.OM的诱导表达及鉴定。
　　方法：
　　实验一：大鼠癌钙调蛋白_OM基因原核表达载体的构建及鉴定
　　1.从SD大鼠腹腔中提取巨噬细胞培养活化，经巨噬细胞特异性抗体CD68鉴定；
　　2.从活化的巨噬细胞中提取总RNA,利用相应引物，通过RT-PCR的方法获得OM基因序列，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；
　　3.通过中间载体PUC57进行目的基因克隆，将阳性克隆质粒酶切，与原核表达载体PET-22b(+)连接，构建PET-22b(+)-OM原核表达质粒，经菌检PCR、DNA测序鉴定。
　　实验二：大鼠癌钙调蛋白_OM基因原核表达载体在大肠杆菌中的表达及鉴定
　　PET-22b(+)-OM重组质粒转化入大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达，SDS-PAGE观察表达产物，Western-blot鉴定。
　　结果：
　　1.1％琼脂糖凝胶电泳获得目的基因OM，大小为346bp左右，与设计的预期目的基因大小一致；
　　2.回收目的基因OM与中间载体PUC-57连接后转化入大肠杆菌感受态细胞DH5a，菌检PCR获得长度500bp左右的阳性克隆,与预期大小完全一致。抽提质粒PUC-57-OM,DNA测序鉴定证实与预期序列一致。
　　3.质粒PUC-57-OM酶切后与载体PET-22b（+）连接转化入大肠杆菌感受态细胞DH5a，抽提质粒PET-22b（+）-OM,经酶切鉴定及DNA测序后证实与预期序列一致。
　　4.重组表达质粒pET22b(+)-OM转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导蛋白表达，经SDS-PAGE电泳分析表明目的蛋白OM主要以可溶形式存在于细菌裂解后的上清中，并经过westernblot鉴定确定为目的蛋白OM。
　　结论:
　　大鼠癌钙调蛋白在原核细胞中成功表达,为OM的获得提供了一条切实可行的途径。为后续实验中,蛋白的活性研究及进一步探讨其促进轴突再生的作用机制奠定了基础。

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缩略语表

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前 言

文献回顾

1. 视神经损伤后视网膜神经节细胞的存活和轴突再生的研究进展

2. 癌钙调蛋白的研究进展

正 文

实验一 大鼠OM基因原核表达载体的构建和鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 大鼠 OM 基因在大肠杆菌中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢