VEGF介导的血管内皮通透性增高的分子机制及其在肾综合征出血热发病中的作用

摘要

汉坦病毒（Hantavirus,HV）属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae），汉坦病毒属中的某些病毒如汉滩（型）病毒（hantaanvirus,HTNV）、汉城（型）病毒（Seoulvirus,SEOV）、新诺柏（型）病毒（Sinnombrevirus,SNV）等，可以感染人类并引起肾综合征出血热（hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome,HFRS）和汉坦病毒肺综合征（hantaviruspulmonarysyndrome,HPS）。自1976年李镐汪等从韩国邻近三八线的HFRS疫区捕获的黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒76-118株以来[1]，各国学者相继分离到不同型别的汉坦病毒，其中汉滩病毒和汉城病毒是引起我国HFRS传播流行的主要病毒型别。
　　虽然经过近半个世纪的防控努力，我国HFRS的发病率已明显下降，但由于迄今对HFRS缺乏有效特异的临床治疗措施，在重点疫区特别是国内姬鼠型疫区，该病重型和危重型的临床救治仍存在许多困难，病死率仍居高不下。自20世纪70年代汉坦病毒成功分离之后，各国学者对汉坦病毒及其相关疾病的基础和临床研究已取得了长足的进展，但是迄今该病的发病机理并未完全阐明，临床也无特异有效的治疗药物。因此，继续不断深入探讨HFRS/HPS的发病机制，积极研发特异的抗病毒治疗药物，仍然是该病防治研究的难题和热点。
　　已知导致HFRS血管渗漏的机制较多，血管内皮调控通透功能的损伤或丧失在发病过程中起着至关重要的作用。近年研究发现，血管内皮生长因子（VEGF）的表达和分泌增多，可能是本病血管渗漏的重要病理机制。此外，内皮细胞间的多种连接蛋白在调节血管通透性方面同样起着重要的作用，后者与VEGF的关系也日益受到关注。
　　本研究首先观察了肾综合征出血热（HFRS）患者各病期外周血VEGF、可溶性(游离)血管内皮生长因子受体2（sVEGFR2）、血管生成素-1（ANG-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和γ干扰素（IFN-γ）水平的变化。然后应用RNAi技术，分析了VEGF对HTNV感染的体外培养的血管内皮细胞通透性以及对细胞间重要连接蛋白Claudin-1和VE-cadherin表达的影响，在此基础上分析探讨了病毒与VEGF、Claudin-1和VE-cadherin之间的相互作用及其对血管内皮细胞通透性的影响。
　　本研究的主要结果如下
　　1．HFRS患者外周血VEGF等细胞因子水平的变化情况
　　首先检测了68例不同病期患者外周血上述5种细胞因子的表达情况，并以20例健康人作为对照。其次，为了验证VEGF的检测结果，又对20例HFRS患者病程5期连续动态收集的外周血标本中的VEGF进行了测定。在所有观察患者中，血浆VEGF水平从发热期开始增高，休克期达到峰值，少尿期开始迅速下降，在多尿期和恢复期回落到正常水平。sVEGFR2、ANG-1水平在休克、少尿、多尿期均低于健康对照；TNF-α和IFN-γ水平在发热期、低血压休克期、少尿期和多尿期均高于健康对照组，其中大多数与后者比较有明显差异。此外，对20例各病期连续动态采集的血样进行验证检测表明，VEGF在休克期表达确实明显升高，与其它各期（212.5～397.5pg/mL）比较均有显著性差异。
　　2．VEGF等细胞因子对HTNV感染的体外培养细胞的作用以及通透性的检测
　　2.1VEGFR2siRNA表达载体的构建及稳定转染细系的构建
　　本实验利用siRNA表达质粒pSilencer4.1-CMVneo在细胞内转录shRNA。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上（RISC），该复合物能够结合到目的mRNA。为避免瞬时转染造成的维持时间短、转染效率低等缺点，本实验即构建了一个可在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）内持续转录出shRNA的表达载体pSilencer-VEGFR2，它包含有一个G418抗性基因，在选择性压力的培养下，可在HUVEC细胞内稳定表达出VEGFR2shRNA。
　　2.2TRANSWELL法检测不同因子作用后内皮细胞通透性的变化
　　以前述体外培养的HUVEC和采用siRNA技术建立的VEGFR2基因敲除血管内皮细胞（HUVECVEGFR2(-)）为研究对象，观察HTNV感染或/和各种细胞因子作用后内皮细胞通透性的变化。结果显示：HTNV单独感染并不能直接增加内皮细胞的通透性，但是加入VEGF后即可明显增强内皮细胞的通透性。在各种影响内皮细胞通透性的因素中，VEGF+HTNV的作用最强，其次为单用VEGF、TNF-α或IFN-γ。对于HUVECVEGFR2(-)细胞的结果显示，应用VEGF刺激HTNV感染前后的两种细胞对HUVEC通透性的影响大于VEGFR2(-)细胞。实验结果还显示，通透抑制因子Ang-1不仅可以抑制VEGF增强血管内皮通透性这一效应，也可以减弱或抑制HTNV感染后内皮细胞对VEGF作用的增强效应，可以减低HTNV感染后内皮细胞对VEGF的敏感性。
　　以上实验结果表明，HTNV感染血管内皮细胞可以增加细胞对VEGF的敏感程度；应用基因敲除VEGFR2的细胞试验进一步证明，在调节VEGF介导的内皮细胞通透性增高方面，减低或抑制VEGFR2的表达具有和Ang-1类似的作用，均可抑制HTNV感染致血管内皮通透性增高的作用。
　　3VEGF介导的细胞间连接蛋白的变化与血管通透性的关系
　　VEGF通过跨细胞途径（transcellularpathway/route）不仅可以直接导致内皮细胞通透性增高，而且可以直接或间接的影响细胞间紧密连接蛋白Claduin-1和黏附连接蛋白VE-cadherin的表达，通过细胞旁途径（paracellularpathway/route）来调节血管内皮通透性。
　　4单层细胞跨膜电阻值(TEER)的测定
　　通过测定培养的单层血管内皮细胞的跨膜电阻（trans-endothelialelectricalresistance,TEER）可以直接反映内皮的通透性。单层培养感染HTNV和未感染的血管内皮细胞，在第7日时TEER分别稳定在13?·cm2和10?·cm2，然后动态监测VEGF刺激HTNV感染和未感染的细胞，在加入VEGF3h时，TEER下降幅度较大，之后逐渐趋缓。证明跨膜电阻下降，细胞间连接被破坏，在VEGF刺激3h时达到峰值。
　　在以上实验的基础上，应用real-timePCR和westernbolt分别检测VEGF、Clandin-1、VE-cadherinmRNA水平以及蛋白水平的表达。并且通过流式细胞术，验证VEGF刺激HTNV感染的内皮细胞上述两种蛋白的表达。最后，通过间接免疫荧光观察细胞膜上两种蛋白的表达。
　　Real-timePCR结果显示：HTNV感染内皮细胞后可上调VEGFmRNA的转录，轻微下调Clauin-1和VE-cadherin的转录。用VEGF刺激HTNV感染的内皮细胞，Claudin-1和VE-caherin的转录均明显下调。Westernblot分析表明，HTNV感染内皮细胞后VEGF的表达未观察到明显变化，Claudin-1和VE-cadherin的表达与real-timePCR结果一致。应用流式细胞仪与间接免疫荧光法检测VEGF刺激HTNV感染的HUVEC上述两种蛋白的表达，结果与PCR和westernblot的研究结果一致。
　　结论：HFRS患者血管通透性增高可能与休克期VEGF高表达有关，sVEGFR2、ANG-1、TNF-α、INF-γ表达量的变化可能在VEGF介导的血管通透性增高中发挥协同或拮抗作用。体外试验证明HTNV感染可增加VEGF对血管内皮细胞作用的敏感性，这一效应可被生理浓度的ANG-1所抑制；应用基因敲除VEGFR2的细胞试验进一步证明，在调节VEGF介导的内皮细胞通透性增高方面，减低或抑制VEGFR2的表达具有和ANG-1类似的功效。与此同时，VEGF可下调Claudin-1和VE-cadherin的表达，从而可能通过细胞旁路/途径增强血管内皮的通透性。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1. 汉坦病毒的基本结构和分类特性

2.肾综合征出血热的流行病学

3．HFRS血管渗漏的机制涉及多种因素

4． 血管内皮通透性增高的发生部位以及途径

正文

实验一 肾综合征出血热患者不同病期外周血VEGF等细胞因子水平的变化及其与血管内皮损伤的关系

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 VEGF介导的细胞间连接蛋白的变化与血管通透性的关系

1 材料

2 方法

3 结果

4. 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢