我国Irkut病毒驯化及其糖蛋白重组腺病毒免疫特性研究

摘要

狂犬病是一种高致死性人兽共患传染病，主要由弹状病毒科（Rhabodoviridea）狂犬病毒属（Lyssavirus）成员感染哺乳动物中枢神经系统引起。目前，狂犬病毒的种类有15种，除MOKV和IKOV外，其余13种病毒均以蝙蝠为主要储存宿主。我国迄今唯一一株蝙蝠狂犬病毒是由笔者所在实验室于2012年从吉林省分离得到。该病毒IRKV-THChina12是狂犬病毒属（Lyssaivrus）伊尔库特河病毒（Irkut virus，IRKV）分离株。进一步研究表明，其与我国广泛流行的基因I型狂犬病病毒（Rabies virus，RABV），在基因序列、致病性和免疫原性方面，均存在明显差异。有研究报道，目前市售的狂犬病生物制品（疫苗和抗体）只能通过暴露前预防接种阻断IRKV感染，但不能提供有效的暴露后免疫保护。IRKV与RABV之间，仅存在部分免疫交叉。因此，有必要开展我国蝙蝠狂犬病毒的细胞驯化及免疫原性研究，从而为特异性预防制品开发奠定基础。
　　本研究通过对IRKV-THChina12适应细胞培养前后全基因组序列对比分析，并与多个不同种属狂犬病毒株的氨基酸比对，分析了我国伊尔库特河病毒IRKV-THChina12株适应细胞培养后的分子生物学特性。结果显示，适应细胞培养后共发生11个核苷酸突变并造成5个氨基酸突变，其中1个氨基酸变异发生在P蛋白负责与LC8相互作用的区域，2个氨基酸突变发生在M蛋白编码区，1个氨基酸突变发生在G（333位精氨酸未改变）蛋白编码区，L蛋白仅有1个氨基酸突变。以上表明，可能多个结构蛋白同时决定了病毒在 Vero细胞的适应性。明确本细胞适应毒株的分子生物学特性，为在细胞水平开展相关科学研究奠定了基础。
　　选取IRKV-THChina12病毒分离株的G基因为靶基因，构建了表达IRKV糖蛋白的重组人5型腺病毒活载体疫苗，并命名为rAd5-IRKV-G。Western-blot和间接免疫荧光试验证明，IRKV-THChina12的G蛋白在重组腺病毒感染的293AD细胞中得到表达。将rAd5-IRKV-G对小鼠进行腹腔免疫和肌肉免疫，同时设立wt-rAd5对照，实验表明两组免疫方式均诱导小鼠产生抗IRKV中和抗体，且rAd5-IRKV-G组与wt-rAd5组差异显著（p≤0.05），腹腔组与肌肉组无显著差异（P＞0.05）。对金黄地鼠单次免疫和两次免疫实验表明，两组均诱导地鼠产生抗IRKV中和抗体，且两组平均中和抗体效价差异不显著（P＞0.05）。
　　试验结果表明，本研究初步明确了IRKV-THChina12细胞培养的分子生物学特性，且成功构建了表达IRKV-THChina12糖蛋白的复制缺陷性重组腺病毒，该重组腺病毒免疫原性较好。

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前言

文献综述

1 蝙蝠狂犬病的研究进展

2 腺病毒及腺病毒载体的研究进展

试验一 蝙蝠狂犬病毒IRKV-THChina12 株适应细胞培养后的生物学特性

1材料与方法

2结果

3 讨论

4 小结

试验二 IRKV-THChina12糖蛋白重组人5型腺病毒的构建及鉴定

1材料与方法

2 结果

3 讨论

4小结

试验三 重组腺病毒的免疫试验

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

缩略词表

附录

致谢

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