表达鸡传染性支气管炎病毒S1和N蛋白重组腺病毒构建及免疫特性研究

摘要

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸道疾病。IBV易变异且血清型众多,各血清型毒株间没有或仅有很小的交叉保护性,给该病的防治带来很大困难。
　　 疫苗免疫接种是预防和控制该病较为有效的措施之一。传统疫苗包括灭活苗和减毒活疫苗存在许多不足如减毒疫苗的安全性差、有毒力返强的潜在危险以及保存条件苛刻等；灭活疫苗存在免疫力不持久,用量大且制备过程复杂,费用较高等缺点。因此,开发新型疫苗如亚单位疫苗、病毒活载体疫苗、DNA疫苗、转基因植物可食用疫苗等逐渐成为疫苗领域研究的热点。
　　 本研究以人5型腺病毒(Ad5)为载体,以IBV地方分离株(CK／CH／LHLJ／04V)有效免疫原基因S1和N基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组的方法构建了两株分别表达IBV S1和N蛋白的重组腺病毒,分别命名为rAd-S1和rAd-N。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及Westernblot检测证实S1和N蛋白在重组腺病毒中均获得表达。对重组腺病毒分别传代至15代,分别提取第8代、第10代、第12代和第15代重组毒基因组,通过PCR、序列测定表明,插入的外源基因遗传性稳定。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该两株重组腺病毒的毒价均达到1010TCID50／mL,而且重组腺病毒与亲本毒在生长动力学方面无显著差异。
　　 为进一步研究表达IBV S1、N蛋白重组腺病毒免疫学特性,采用两个标准进行评价:一是重组毒免疫鸡,检测抗体应答水平;二是免疫保护试验。将55只SPF鸡平均分成五组,每组11只,分别记为A组、B组、c组、D组和E组。前三组为实验组,后两组为对照组。在鸡3日龄时开始免疫,A、B组分别免疫重组毒rAd-S1、rAd-N。C组3日龄时先用重组毒rAd-N首免,7天后用rAd-S1加强免疫一次。免疫途径为肌肉注射,免疫剂量均为200μL(1010TCID50／mL)。D组为疫苗株LDT3-A免疫组,滴鼻免疫,使用剂量为100μL(106EID50／mL),E组为亲本腺病毒免疫组。各组首免后分别于第5d、10d、15d和20d采集血清以检测抗体水平。ELISA检测结果显示,疫苗免疫组能够检测到一定水平的抗体,且在免疫后第15天其OD630值达到高峰,最高值达0.8。试验组采用Western blot方法检测,分别裂解各重组腺病毒rAd-S1、rAd-N作为抗原,检测各组内每只鸡免疫后抗体产生情况。裂解IBV全病毒作为阳性对照。结果显示,重组腺病毒免疫组在首免后第15天和第20天均有一定数量的鸡只分别产生了针对S1和N蛋白的抗体,而亲本腺病毒免疫组没有鸡产生抗体。首免后第21天用IBV强毒株进行攻毒并连续观察25天。试验结果显示,攻毒后A组、B组、C组、D组和E组的发病率分别为:27.3％、54.5％、63.6％、0、100％,各组死亡率分别为:18.2％、45.5％、54.5％、0、81.8％。
　　 本研究结果显示,与疫苗株和亲本腺病毒相比,表达IBV S1和N蛋白的重组腺病毒免疫后均能诱导机体产生抗体,并对毒强度攻击产生一定水平的保护作用,但是表达IBV S1蛋白的重组腺病毒较表达N蛋白的重组腺病毒对IBV强毒的攻击提供较高的保护作用。
　　 本研究为开发鸡传染性支气管炎新型重组活载体疫苗提供借鉴。