鸡传染性支气管炎病毒的分离及其S1基因重组5型腺病毒的构建

摘要

鸡传染性支气管炎(InfectiousBronchitis，IB)是由冠状病毒科(Coronavirdae)冠状病毒属(Coronavirus)传染性支气管炎病毒(InfectiousBronchitisVirus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，给养禽业造成重大损失。鸡传染性支气管炎在免疫鸡群中的频繁暴发，给该病的免疫防控带来了极大的困难。
　　 本研究通过病毒形态观察、致鸡胚矮小化试验、血凝试验等分离获得1株鸡传染性支气管炎病毒，命名为QS10株。利用RT-PCR对其S、N基因进行了扩增和序列分析，并绘制了S1基因核苷酸序列系统进化树。结果显示，QS10在电镜下呈直径80～120nm的圆形粒子，接种鸡胚100％出现侏儒胚和死亡胚，血凝效价为1∶1024，EID50为107.38/0.2ml，该分离毒株与中国常用疫苗毒株、国内流行毒株亲缘关系均较远，而与澳大利亚流行毒株S1基因的核苷酸序列同源性达91.4％～99.6％，推测该毒株与澳大利亚流行毒株可能具有相同的进化来源。
　　 参照QS10株S1基因的全序列设计一对引物，通过RT-PCR克隆到S1基因，将其连接至pUC19载体，测序鉴定正确后，利用HindⅢ和BamHⅠ双酶切将S1基因从重组克隆质粒上切下，连接至相同酶切处理的腺病毒穿梭质粒载体pacAd5CMVK-NpA中，酶切及测序鉴定重组穿梭质粒命名为pacAd5CMV-S1。利用限制性内切酶PacⅠ将上述构建好的重组穿梭质粒线性化，与同样利用PacⅠ酶切线性化并回收的腺病毒骨架质粒pacAd59.2-100共同转染人胚胎肾HEK293AD细胞系，在HEK293AD细胞中完成同源重组，并包装出携带S1基因的重组人5型腺病毒，命名为rAd5-S1，另外，利用线性化的pacAd5CMVK-NpA和pacAd59.2-100重组获得的腺病毒命名为wt-rAd5;4～9代传代后，各个重组病毒的培养滴度都能达到107TCID50。
　　 获得重组病毒后，对其进行电镜观察表明获得的病毒具有典型的腺病毒形态;用重组腺病毒感染HEK293AD细胞，提取细胞总RNA，通过RT-PCR，在转录水平上证明了重组腺病毒能够介导靶基因在真核细胞中表达;最后，对感染重组病毒后的HEK293AD细胞做间接免疫荧光染色和细胞总蛋白做Western-blot检测，结果在蛋白水平上证明了靶基因在被感染细胞中的表达。
　　 综上所述，本研究从病死鸡的腺胃组织中分离到一株与澳大利亚流行毒株可能具有相同进化来源的鸡传染性支气管炎病毒，命名为QS10株;以该分离毒株的S1基因为靶基因，成功构建了介导表达QS10株S1蛋白的复制缺陷性人5型腺病毒，并在形态学和分子生物学两方面对该重组腺病毒进行了鉴定，为研究安全高效的IBV重组腺病毒疫苗奠定了基础。

目录

声明

摘要

前言

第一篇 文献综述

1 鸡传染性支气管炎概述

2 鸡传染性支气管病毒的分子生物学研究进展

2．1 鸡传染性支气管炎病毒粒子结构

2．2 鸡传染性支气管炎病毒基因组结构

2．3 鸡传染性支气管炎病毒的结构蛋白

3 鸡传染性支气管炎疫苗的研究进展

3．1 传统疫苗

3．2 基因工程疫苗

4 腺病毒及腺病毒载体的研究进展

4．1 腺病毒的生物学特性

4．2 腺病毒的侵染机制

4．3 腺病毒载体的种类及特点

4．4 腺病毒载体的应用

第二篇 研究内容

试验一 鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定及S基因的序列分析

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

试验二 表达鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

英文缩写词表

附录

致谢