低温真菌线粒体基因组测序及注释分析

摘要

低温真菌分布于地球的海洋深处、高山、两极、冰川等一些营养条件匮乏、环境恶劣的地方。根据温度特性把低温真菌分为嗜冷真菌和耐冷真菌。它们长期在0℃左右的低温环境中生存，已经生成了独特的应答和防御系统，比如耐冷/耐冻性、脱水能力、缺氧适应性和产生抗冻化合物等。以往对于低温真菌的研究多集中在形态学方面，而在分子生物学方面的研究相对较少，目前GenBank收录的低温真菌线粒体基因组数据也极少。
　　本文测定了两种低温真菌Pseudogymnoascus pannorum(syn. Geomyces pannorum)和Leptosphaeria sclerotioides(syn.Phoma sclerotioides)的线粒体基因组序列，并对其进行序列注释和分析；结合已测序的其他真菌的线粒体基因组的数据，从基因组大小、排列顺序、tRNA基因、rRNA基因、氨基酸密码子的使用情况以及碱基组成等方面进行分析和比较，并且进行系统发育分析。Pseudogymnoascus pannorum是子囊菌门、Leotiomycetes纲、Pseudeurotiaceae科的一种丝状真菌，主要分布在南极或高山多年冻土中，最适合的生长温度为10～20℃，最主要特征是在零下5℃可以生长，与纤维素的分解和垃圾填埋场土壤埋藏的聚酯型聚氨酯的降解有关。Leptosphaeria sclerotioides是一种土壤真菌，属于子囊菌门、Dothideomycetes纲、Pleosporales目，Leptosphaeriaceae科，主要分布南极和其他寒冷的土壤中，是西藏冻土的主要物种，最适合的生长温度也是10～20℃，最主要是特征是在零下4℃可以生长，是一种温带雪霉病和褐根腐病的病原。Pseudogymnoascus pannorum线粒体基因组为一个环状的DNA分子（GenBank登录号：KR055655），长度26918 bp，包括13个蛋白质编码基因，27个tRNA基因、2个核糖体RNA基因（rnl和rns）和一个开放阅读框（orf120），rnl基因包含有一个编码核糖体蛋白S3（rps3）基因的开放阅读框，大小为1458 bp。但是与其他真菌相比， Pseudogymnoascus pannorum缺失 atp9基因。基因的排列顺序是rnl-nad2-nad3-nad4-cox2-cox1-orf120-atp8-nad4L-nad5-cob-nad1-atp6-rns-nad6-cox3。Pseudogymnoascus pannorum线粒体基因组中nad2和nad3，nad4L和nad5基因紧密相连，彼此重叠。其基因组各区段的A+T含量都很高，非编码区中的A+T含量最高，达到了80.4％。对于氨基酸密码子的使用偏好A或U，而且蛋白质的起始密码子除了cox1基因是ATT外，其余的均为ATG，cob基因的终止密码子是TAG外，其余的均为TAA。tRNA基因长度一般在70-90bp左右，分散在rRNA基因和蛋白质基因之间，rnl基因两侧最多，而且相邻的tRNA基因有的紧密相连甚至重叠，有的间隔1-30个碱基。基因tRNASer、tRNASer、tRNALeu、tRNALeu和tRNATyr多DHC臂，并非典型的三叶草结构。和其它生物线粒体基因组一样，Pseudogymnoascus pannorum线粒体tRNA二级结构中也发现了碱基的错配G：U和A：C。Leptosphaeria sclerotioides的线粒体基因组实验还在进行，已知的序列包括2个核糖体RNA基因（rnl和rns），10个蛋白编码基因（cox1、cox2、cox3、cob、nad1、nad2、nad4、nad4L、nad5、nad6）。

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第一章 前言

1.1 线粒体基因组的研究概况

1.1.1 线粒体概述

1.1.2 线粒体的起源与进化

1.1.3线粒体基因组简介

1.1.4 线粒体基因组的研究方法

1.2 真菌线粒体基因组的结构和特征

1.2.1 真菌线粒体基因组的基因组成

1.2.2 低温真菌研究概况

1.2.3 Pseudogymnoascus pannorum的概述

1.2.4 Leptosphaeria sclerotioides的概述

1.3 研究的目的和意义

第二章 Pseudogymnoascus pannorum全基因组测序及注释分析

2.1 实验材料、仪器和试剂

2.1.1 材料

2.1.2.仪器和试剂

2.1.3 培养基和试剂的培养

2.2实验方法

2.2.1 技术路线

2.2.2 菌株的培养

2.2.3 菌株保藏

2.2.4 DNA的提取方法

2.2.5 PCR引物设计

2.2.6 DNA片段的扩增

2.2.7 PCR产物回收纯化

2.2.8 基因克隆

2.2.9 数据分析

2.3 研究结果

2.3.1 完整线粒体基因组的基因结构和顺序

2.3.2 核苷酸组成特征

2.3.3 蛋白质编码基因密码子使用情况

2.3.4 基因重叠与间隔

2.3.5 rRNA基因

2.3.6 tRNA基因和二级结构预测

2.3.7 系统发育分析

2.4 小结

第三章 Leptosphaeria sclerotioides全基因组测序及注释分析

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 线粒体基因组分析

结论与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

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