海地瓜（Acaudina Molpadioidea）胶原蛋白水解物中血管紧张素转移酶抑制肽的研究

摘要

本文研究了海地瓜体壁胶原蛋白的提取方法，单酶和复合酶水解海地瓜胶原蛋白制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制活性肽的工艺条件以及ACE抑制活性肽的纯化及其部分特性。 采用酸法、酶法、热水浸提法从海地瓜体壁中提取胶原蛋白，提取率分别为4.72％，29.30％，53.50％。从实验结果可看出热水浸提法提取率最高，酸法提取率最低。酶促溶法的提取率虽然不低，但提取工艺相对繁琐。因此本实验选择热水浸提法制备海地瓜胶原蛋白。 采用硫酸铵沉淀法成功地从猪肺中提取得到高活力的ACE酶。即以新鲜的猪肺为原料，在低温条件下用硼酸缓冲液浸提，得到的粗酶液再通过硫酸铵分级沉淀和凝胶过滤等方法进一步纯化，纯化后的ACE酶液比活力为63.36U。 以海地瓜胶原蛋白为原料，选用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、3942中性蛋白酶、I型胶原酶、Alcalase 2.4L蛋白酶进行水解。以单酶水解产物的工C<,50>值为评价指标，确定了菠萝蛋白酶、Alcalase 2.4L蛋白酶、I型胶原酶作目标酶。通过正交实验，确定了这三种单酶的最适水解条件。结果表明：菠萝蛋白酶最适水解条件为：45℃，pH4.5，底物浓度1.0％，加酶量200U／g，4h；Alcalase 2.4L蛋白酶最适水解条件为：55℃，pH7.5，底物浓度1.5％，加酶量200@I／g，2h：I型胶原酶最适水解条件为：37℃，pH7.4，底物浓度1.0％，加酶量1500U／g，4h。在单酶和正交实验的基础上，采用复合酶进行水解实验，得到了最适复合酶水解二[艺条件：先采用菠萝蛋白酶进行水解，再用A1calase 2．4L酶水解，最后用I型胶原酶水解。复合酶解工艺中，这三种酶的水解液分别经过10KDa、5KDa、1．KDa的膜超滤，优化了复合酶解工艺，得到了具有更高的ACE抑制活性的组分，其水解液的IC<,so>值为0.35mg／ml。 利用SP Sephadex C-25阳离子交换、Sephadex G-15凝胶柱层析、两次反相高压液相色谱层析对复合酶水解产物进行分离纯化，得到高活性的ACE抑制肽，其ICso值为0.0142mg／ml。 经氨基酸分析仪分析，提纯后的ACE抑制肽主要由Glu、Asp、Pro、Gly、Ala组成，这5种氨基酸的总摩尔含量在90％以上。质谱分析测定其分子量分布在4lO-950Da之间。

目录

文摘

英文文摘

0前言

1海地瓜胶原蛋白的提取

2 ACE酶的提取及活性检测

3海地瓜胶原蛋白酶解液的制备

4 ACE抑制活性肽的纯化及其部分特性的研究

5总结

参考文献

致谢